组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
三氟哌嗪（trifluoroperazine, TFP），样品基质：人尿（加标人尿）
检测原理
该传感器以基因工程人钙调蛋白突变体hCaM M124C-mBBr为识别元件。TFP作为钙调蛋白拮抗剂，与hCaM的配体结合位点发生非共价特异性结合。结合事件引起蛋白局部构象变化，改变共价连接在Cys124位点的单溴双咪胺（mBBr）荧光团的微环境，导致其荧光发射强度发生猝灭。TFP浓度越高，结合量越大，荧光猝灭幅度越大，因此荧光强度变化ΔIF与TFP浓度呈线性关系。检测时样品在连续流微池中流过固定有hCaM M124C-mBBr的CPG传感层，分叉光纤将激发光导入传感区并收集发射光，荧光分光光度计在381 nm激发、466 nm发射下读取信号。由于TFP与蛋白结合可逆，缓冲液冲洗即可再生传感层。
检测灵敏度
LOD: 0.24 μg mL−1；定量限: 0.52 μg mL−1；线性范围: 0.52–61.05 μg mL−1；斜率: 0.285 a.u. per μg mL−1；R^2 = 0.998
效应效果
该传感器对苯甲酰胺阴性对照无信号变化，表明对TFP具有良好选择性。日内重复性和日间重现性分别低于1.4%和2.7%；传感层在4 ℃避光保存下连续6个月校准无显著差异，长期稳定性良好。响应时间t100约43 s（摘要报告<42 s），恢复时间<4.5 min，自动化系统约可分析12个样品/小时。加标人尿中TFP回收率为97%–101%，RSD<5.9%；与HPLC-DAD结果比较，回收率为98%–102%，RSD为0.60%–0.95%，t检验显示两方法准确度无显著差异。该传感器无需固相萃取或预浓缩，可直接分析稀释尿样，适合药物和临床样品高通量筛查。
传感器的构成
- 基底/载体：控制孔玻璃珠（CPG），平均粒径41 μm、孔径200–240 Å、比表面积300 m2/g，提供高比表面积并固定传感蛋白
- 表面功能化层：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），在CPG表面引入氨基反应位点
- 交联固定层：戊二醛（glutaraldehyde）与氰化硼氢化钠（NaBH3CN），通过亚胺键形成共价连接并稳定蛋白
- 识别元件：基因工程人钙调蛋白突变体（hCaM M124C-mBBr），作为生物模拟识别元件特异性结合TFP
- 信号标记物：单溴双咪胺（mBBr）荧光团，共价连接于Cys124，TFP结合后发生荧光猝灭
- 封闭剂：乙醇胺（ethanolamine），封闭残余醛基，减少非特异性结合
- 流通池：玻璃流通微反应器，内尺寸9.3×2.0×0.25 mm、腔体5 μL，装填CPG并实现连续流检测
- 光学读出：分叉光纤（bifurcated optical fiber）与荧光分光光度计（spectrofluorometer），激发381 nm、发射466 nm采集荧光信号
中文摘要
本文报道了一种基于荧光标记人钙调蛋白（CaM）突变体hCaM M124C-mBBr的在线荧光生物传感器，用于检测人尿中吩噻嗪类药物三氟哌嗪（TFP）。该突变体通过戊二醛共价固定于经3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）功能化的控制孔玻璃（CPG）珠上，并装填于连续流微池中；微池连接分叉光纤与荧光分光光度计，实现自动化在线监测。研究优化了流速、进样体积、载流缓冲液种类、浓度和pH等参数。在最佳条件下，传感器对TFP的检出限和定量限分别为0.24和0.52 μg/mL，动态范围为0.52–61.05 μg/mL（n=5，相关系数0.998）。响应时间t100小于42 s，恢复时间小于4.5 min；线性范围内重复性和重现性分别低于1.4%和2.7%。该传感器成功用于加标人尿中TFP分析，回收率为97%–101%，RSD低于5.9%。
英文摘要
This paper describes the development of a novel on-line biosensor based on a fluorescently labeled human calmodulin (CaM), hCaM M124C-mBBr, immobilized on controlled-pore glass (CPG), for the analysis of trifluoroperazine (TFP); a phenothiazine drug in human urine samples. The device was automated by packing hCaM M124C-mBBr-CPG in a continuous-flow microcell connected to a monitoring system, composed of a bifurcated optical fiber coupled to a spectrofluorometer. Operating parameters of the on-line biosensor (flow rate, sample injection volume, and carrier solution and buffer pH) were studied and optimized. Under the optimal conditions, the biosensor provides a detection and a quantification limit of 0.24 and 0.52 μg mL(-1), respectively, and a dynamic range from 0.52 to 61.05 μg mL(-1) TFP (n = 5, correlation coefficient 0.998). The response time (t(100)) was shorter than 42 s (recovery time <4.5 min) and reproducibility and repeatability of the TFP measurements, within the linear response range, were lower than 1.4 and 2.7%, respectively. The device was successfully applied to the analysis of TFP in spiked human urine samples with recoveries ranging between 97 and 101% and with RSDs lower than 5.9%.