组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
活性转录因子CAP（catabolite activator protein，CAP）二聚体；样品基质：纯化蛋白溶液、E. coli细胞裂解液
检测原理
传感器为含三个A5 kink和CAP结合位点的双链DNA，A5 kink使末端距离预置在Förster距离附近，提高对距离变化的灵敏度。无CAP时，供体Cy3B与受体ATTO647N之间呈中等FRET效率。活性CAP二聚体在cAMP存在下结合operator，诱导约80–90°DNA弯曲，使DNA末端距离增大，FRET效率下降。ALEX交替激发供体/受体，对双标记分子按FRET效率E*和化学计量S分类，单分子FRET分布随CAP浓度变化，从而定量检测活性CAP。该设计通过序列导向弯曲放大蛋白诱导的构象变化。
检测灵敏度
KD: ~58 nM（单分子FRET，Hill拟合）；ensemble-FRET: ~30 nM；测试浓度范围: 0–600 nM active CAP dimer
效应效果
表面固定传感器在无CAP时E*为0.35±0.01；加入1.2 µM活性CAP二聚体和0.2 mM cAMP后E*降至0.22±0.01，洗脱三次并孵育30 min后恢复至0.34±0.01，显示可重复使用。在大肠杆菌裂解液（10 mg/mL，含高表达CAP）中，不加cAMP时E*为0.36±0.02，加入0.2 mM cAMP后降至0.25±0.01，表明对活性CAP具有特异性响应且抗复杂样品干扰。检测时间约15 min，短于ELISA、染色质沉淀或PCR方法。作者认为该策略可扩展至NF-κB、SRY、Sox2等DNA弯曲蛋白，并通过光谱或空间编码实现多路检测。
传感器的构成
- 基底/换能器：玻璃盖玻片（glass coverslip）与TIRF/共聚焦荧光显微镜，提供表面固定和光学读出
- 表面固定层：PEG-Biotin与PEG（1.25:100）涂层，经链霉亲和素（neutravidin）连接生物素化DNA
- 传感元件：双链DNA传感器（72-mer与68-mer退火），含三个A5 kink和CAP结合位点，形成可弯曲结构
- 识别元件：CAP特异性DNA结合位点（wild-type CAP operator），识别活性CAP二聚体
- 信号标记物：FRET供体Cy3B标记top strand 5′端，FRET受体ATTO647N标记bottom strand 5′端，报告末端距离变化
- 辅助因子：cAMP（cyclic AMP）作为CAP激活辅因子，促进CAP-DNA结合
- 缓冲与封闭：结合缓冲液（20 mM HEPES-NaOH、100 mM potassium-l-glutamate、200 mM NaCl、1 mM DTT、100 mg/mL BSA、1 mM MEA、5% glycerol），维持蛋白活性并减少非特异吸附
中文摘要
转录因子（TF）通过结合DNA并诱导其弯曲调控基因表达，但现有方法难以在单分子水平快速检测活性TF。本文报道一种基于单分子DNA弯曲的FRET蛋白生物传感器。该传感器由一条含三个A5 kink和CAP结合位点的双链DNA构成，两端分别标记FRET供体Cy3B和受体ATTO647N。无CAP时，A5 kink使DNA末端距离接近Förster距离，呈现中等FRET效率；活性CAP二聚体在cAMP存在下结合其结合位点，诱导约80–90°弯曲，使末端距离增大，FRET效率降低。作者利用交替激光激发（ALEX）单分子共聚焦和全内反射荧光显微镜（TIRF）在溶液和表面体系中检测CAP，得到KD约58 nM，并证明传感器可重复使用，且在大肠杆菌裂解液中能特异性响应活性CAP。该策略可用于其他DNA弯曲蛋白的快速检测。
英文摘要
A "bendy" protein sensor: A DNA-based sensor that uses folded DNA (through DNA kinks) and protein-induced bending to detect DNA-binding proteins is presented. Single-molecule sensing of a transcriptional activator (catabolite activator protein, CAP, which bends its DNA site by 80°) is demonstrated in solution and on surfaces, both in buffers and in cell lysates. The method should allow detection of a wide range of DNA-bending proteins.