组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
ATP（三磷酸腺苷，ATP）、腺苷（adenosine，ADO）、谷氨酸（glutamate，GLU）；样品基质：大鼠海马切片胞外空间，人工脑脊液（aCSF）灌注
检测原理
K+ 去极化使海马胶质细胞释放 ATP、腺苷和谷氨酸至胞外。分析物扩散进入多酶微电极的酶固定层：ATP 传感器中甘油激酶（GK）利用 ATP 和甘油生成甘油-3-磷酸，甘油-3-磷酸氧化酶（GPO）将其氧化；腺苷传感器中腺苷脱氨酶（ADA）将腺苷转化为肌苷，核苷磷酸化酶（NP）和黄嘌呤氧化酶（XO）进一步将肌苷/次黄嘌呤氧化；谷氨酸传感器中谷氨酸氧化酶（GOx）氧化谷氨酸。酶催化产生可被铂电极氧化的电活性产物，在 500–700 mV（vs Ag/AgCl）下产生安培电流，电流峰值与胞外分析物浓度正相关。NULL 传感器扣除非特异背景，INO 传感器从 ADO/INO 信号中扣除肌苷，从而获得净 ATP、腺苷和谷氨酸信号。
检测灵敏度
—
效应效果
传感器选择性较好：谷氨酸传感器对谷氨酸优于谷氨酰胺、天冬氨酸、多巴胺和5-HT；NULL与INO电极扣除背景和肌苷干扰。实验前后标准品校准，药物未引起可检测干扰。基线接近检测限（ATP 4.1±0.8 pA、ADO 5.4±0.7 pA、GLU 6.4±0.8 pA），估计为几nmol/L。K+去极化净释放：ATP 1.23±0.23、ADO 10.28±1.41、GLU 3.49±0.84（表中标记mmol·L-1，讨论称低微摩尔）。TTX、无钙、FAc和P2X7拮抗剂显示释放依赖神经元活动、胞外钙与胶质细胞。作者认为该技术可高时空分辨率实时监测胶质递质释放。
传感器的构成
- 换能器电极：细铂丝（Pt wire，直径 50 μm、长 0.5 mm），作为安培工作电极
- 酶固定层：聚合物基质包埋酶，形成多酶微电极识别/催化层
- ATP 识别酶：甘油激酶（glycerol kinase, GK）与甘油-3-磷酸氧化酶（glycerol-3-phosphate oxidase, GPO），用于 ATP 检测
- 腺苷识别酶：腺苷脱氨酶（adenosine deaminase, ADA）、核苷磷酸化酶（nucleoside phosphorylase, NP）和黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase, XO），用于腺苷/肌苷检测
- 谷氨酸识别酶：谷氨酸氧化酶（glutamate oxidase, GOx），用于谷氨酸检测
- 参考电极：NULL 传感器（无酶但结构相同）与 INO 传感器（缺 ADA），用于扣除背景电流和肌苷干扰
- 电子底物：甘油（glycerol）加入人工脑脊液（aCSF），作为 ATP 传感器反应底物
中文摘要
本研究旨在表征高钾去极化诱导的大鼠海马切片中 ATP、腺苷和谷氨酸外流。作者采用多酶微电极生物传感器与细胞外电生理记录，对 ATP、腺苷和谷氨酸的释放进行实时监测。结果显示，25 mM K+ 去极化时，ATP、腺苷和谷氨酸传感器均记录到短暂且可逆的电流，但动力学不同。外源 ATP 酶抑制剂 ARL67156 升高细胞外 ATP 并抑制持续性腺苷外流，提示腺苷主要来自 ATP 的胞外降解。刺激诱导的 ATP、腺苷和谷氨酸外流可被河豚毒素抑制；无钙介质可消除 ATP 和腺苷外流。NMDA 受体拮抗剂 D-AP-5 和 ifenprodil 降低 ATP 与腺苷升高，而非 NMDA 受体拮抗剂 CNQX 仅抑制谷氨酸外流。胶质毒素氟乙酸盐和 P2X7 受体拮抗剂抑制 K+ 诱导的三种物质外流；低浓度 carbenoxolone 和 probenecid 主要降低腺苷外流。结论：海马存在活动依赖性胶质递质释放，ATP 和谷氨酸经 P2X7 受体激活释放，腺苷部分来自 ATP 降解，也可能经 pannexin 半通道直接释放。
英文摘要
BACKGROUND AND PURPOSE: This study was undertaken to characterize the ATP, adenosine and glutamate outflow evoked by depolarization with high K(+) concentrations, in slices of rat hippocampus.
EXPERIMENTAL APPROACH: We utilized the microelectrode biosensor technique and extracellular electrophysiological recording for the real-time monitoring of the efflux of ATP, adenosine and glutamate.
KEY RESULTS: ATP, adenosine and glutamate sensors exhibited transient and reversible current during depolarization with 25 mM K(+) , with distinct kinetics. The ecto-ATPase inhibitor ARL67156 enhanced the extracellular level of ATP and inhibited the prolonged adenosine efflux, suggesting that generation of adenosine may derive from the extracellular breakdown of ATP. Stimulation-evoked ATP, adenosine and glutamate efflux was inhibited by tetrodotoxin, while exposure to Ca(2+) -free medium abolished ATP and adenosine efflux from hippocampal slices. Extracellular elevation of ATP and adenosine were decreased in the presence of NMDA receptor antagonists, D-AP-5 and ifenprodil, whereas non-NMDA receptor blockade by CNQX inhibited glutamate but not ATP and adenosine efflux. The gliotoxin fluoroacetate and P2X7 receptor antagonists inhibited the K(+) -evoked ATP, adenosine and glutamate efflux, while carbenoxolone in low concentration and probenecid decreased only the adenosine efflux.
CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS: Our results demonstrated activity-dependent gliotransmitter release in the hippocampus in response to ongoing neuronal activity. ATP and glutamate were released by P2X7 receptor activation into extracellular space. Although the increased extracellular levels of adenosine did derive from released ATP, adenosine might also be released directly via pannexin hemichannels.