组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
I型胶原C端肽（C-terminal telopeptide, CTx）；样品基质：PBS抗原溶液（文中提及可覆盖血清与尿液生理水平）
检测原理
该传感器采用无标记电化学阻抗免疫检测原理。金电极表面依次构建羧基自组装单分子层、链霉亲和素和生物素化抗CTx抗体，形成特异性识别界面。当溶液中的I型胶原C端肽与抗体结合后，电极表面蛋白层厚度与界面疏水性增加，阻碍[Fe(CN)6]3-/4-电对向金电极表面的电子转移。EIS在0.2 V直流偏置、0.1 Hz–300 kHz频率范围内测量，阻抗半圆直径对应电子转移电阻Ret。抗原浓度升高时，结合量增加，Ret随之增大；在0–3 μg/mL范围内ΔRet与浓度呈线性。数据用Randle等效电路拟合，以Ret作为定量参数，无需二次抗体、荧光标记或酶催化放大。
检测灵敏度
LOD: 50 ng/mL；线性范围: 至3 μg/mL；动态范围: 至3 μg/mL；重现性: 10%标准差内
效应效果
该传感器在0.2 V直流偏置下对SAM、链霉亲和素和抗体结合步骤具有可重复阻抗响应，SAM至链霉亲和素步骤重复性偏差小于5%；抗原检测响应在10%标准差内可重复。荧光显微镜证实抗原结合后出现明显荧光，循环伏安法显示抗体/抗原结合后电流略降。检出限50 ng/mL，动态范围至3 μg/mL，可覆盖文献报道的血清400–20,000 pmol/L和尿液30–1,400 μg/mmol肌酐生理水平。与ELISA相比，无需二次抗体、荧光染色和复杂光学测量，用户仅需孵育约4小时即可读取电信号，并支持连续监测。作者指出未来需优化电极尺寸与表面制备以降低检出限，并研究EDTA、抗坏血酸及其他蛋白干扰。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au electrode），光刻制备，作为工作电极与阻抗换能器
- 绝缘封装：SU-8光刻胶与导电环氧，绝缘电极区域并连接导线
- 自组装单分子层：3,3-二硫丙酸（3,3-dithiodipropionic acid）与16-巯基十二烷酸（16-mercaptoundecanoic acid）混合SAM，提供羧基终端
- 化学活化层：EDC与Sulfo-NHS，将羧基转化为活性NHS酯
- 识别元件：链霉亲和素（streptavidin）与生物素化抗人C端肽抗体（biotinylated anti-human C-terminal telopeptide antibody），特异性识别CTx
- 封闭剂：1%牛血清白蛋白（BSA），封闭非特异性结合位点
- 电子探针：[Fe(CN)6]3-/4-电对（K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6），用于无标记阻抗信号
- 检测液：PBS（pH 7.0）含5.0 mM K3Fe(CN)6与5.0 mM K4Fe(CN)6，用于EIS测量
中文摘要
本文报道了一种基于无标记免疫传感的电化学生物传感器，用于检测I型胶原C端肽（C-terminal telopeptide, CTx）骨转换标志物。在金电极表面构建二硫丙酸自组装单分子层，随后依次固定链霉亲和素和生物素化抗人C端肽抗体，形成识别界面。采用电化学阻抗谱（EIS）表征自组装单分子层、链霉亲和素及生物素化抗体逐步结合过程，并在不同浓度C端肽存在下测量阻抗变化。抗原与抗体结合后阻碍[Fe(CN)6]3-/4-电对界面电子转移，使电子转移电阻增大。该传感器检出限为50 ng/mL，动态范围可达3 μg/mL。据作者所知，这是首次利用直流偏置电化学阻抗实现骨相关降解与重建产物无标记检测。该电子生物传感器有望用于骨健康的定量即时筛查，通过监测骨转换标志物早期发现骨关节炎、骨质疏松等疾病，为早期干预提供依据。
英文摘要
This paper describes the development of a biosensor based on label-free immunosensing for the detection of the C-terminal telopeptide bone turnover marker from type-1 collagen. A self-assembled monolayer (SAM) of dithiodipropionic acid was deposited on a gold electrode. Then streptavidin and biotinylated anti-human C-terminal telopeptide antibody were successively conjugated on the self-assembled monolayer. Electrochemical impedance measurements were made to characterize each step of the SAM/streptavidin/biotinylated antibody binding. Subsequently, electrochemical impedance was measured with different concentrations of C-teminal telopeptide. A detection limit of 50 ng/mL and a dynamic range up to 3 μg/mL were achieved. To our knowledge, this is the first attempt to develop a label-free immunosensor based on electrochemical impedance with DC bias for detection of bone-related degradation and rebuilding products. The electronic biosensor might eventually be used for quantitative point-of-care screening of bone health. It is hoped that analysis of bone turnover markers can indicate the beginning of bone diseases such as osteoarthritis and osteoporosis so that treatment might start early when it is most effective.