组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
检测对象：gentisate（4-羟基-3-甲氧基苯甲酸）、DHICA（5,6-二羟基吲哚-2-羧酸）、reverse T3（3,3',5'-三碘甲状腺原氨酸）、T3（3,3',5-三碘甲状腺原氨酸）、rosmarinate（迷迭香酸）、3-nitrotyrosine（3-硝基酪氨酸）、dihydrocaffeic acid（二氢咖啡酸）、DOPAC、DHPG、3,5-diiodo-L-tyrosine（3,5-二碘-L-酪氨酸）；样品基质：细胞培养体系（HT-29细胞、U2OS-GPR35-bla细胞）。
检测原理
小分子酪氨酸代谢物与细胞表面GPR35结合后，激活G蛋白偶联受体并触发下游信号。在DMR检测中，受体激活引起细胞骨架、膜和细胞器运动等全细胞质量重分布，改变谐振波导光栅（RWG）附近有效质量/折射率，使共振波长发生可逆位移；Epic系统以约15秒间隔实时记录波长变化，DMR幅度随激动剂浓度升高并趋于饱和，从而获得EC50。在Tango检测中，GPR35激活招募β-arrestin/TEV融合蛋白，TEV切割GPR35-Gal4-VP16融合蛋白，Gal4-VP16入核激活UAS控制的β-lactamase报告基因；加入LiveBLAzer FRET B/G底物后，β-lactamase将coumarin转化为fluorescein，FRET比值升高。该体系通过报告基因转录放大和全细胞整合响应提高检测灵敏度。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或R^2；报告EC50：reverse T3 DMR EC50 5.89±0.39 μM；DHICA DMR EC50 24.2±2.7 μM；rosmarinate DMR EC50 29.4±2.7 μM；T3 DMR EC50 50±5 μM；gentisate DMR EC50 69.6±7.1 μM；3-nitro-L-tyrosine DMR EC50 142±27 μM；DHICA Tango EC50 22.9±1.6 μM；reverse T3 Tango EC50 108±9 μM。
效应效果
SPB05142可剂量依赖性抑制多数激动剂诱导的DMR信号，对pamoic acid、zaprinast、cromolyn disodium、niflumic acid、kynurenic acid的IC50分别为3.97±0.24、10.4±0.9、13.5±1.6、13.2±1.4、4.41±0.47 μM；对新激动剂IC50约2.0–9.2 μM，L-DOPA仅部分抑制，提示信号主要特异于GPR35。效能上，reverse T3为zaprinast的108%，DHICA 75%，rosmarinate 63%，T3 40%，gentisate和3-nitrotyrosine低于20%。数据为2次独立实验、n=4的均值±标准差。作者认为多种酪氨酸代谢物可协同调节GPR35，使其成为酪氨酸代谢异常疾病的治疗靶点。
传感器的构成
- 基底/换能器：EpicH 384孔生物传感器微孔板，内置谐振波导光栅（RWG）换能器，用于无标记光学检测细胞质量重分布。
- 细胞识别层：HT-29人结直肠腺癌细胞或U2OS-GPR35-bla工程细胞，作为全细胞识别与信号转导平台。
- 识别元件：细胞表面GPR35 GPCR，结合酪氨酸代谢物激动剂并触发下游信号。
- 信号报告元件：U2OS-GPR35-bla中GPR35-Gal4-VP16-TEV融合蛋白与β-arrestin/TEV融合蛋白，激动剂激活后发生β-arrestin易位和TEV切割。
- 报告基因/底物：UAS控制的β-lactamase报告基因及LiveBLAzer FRET B/G底物，将转录激活转换为coumarin/fluorescein FRET信号。
- 光学读出单元：Epic系统集成光纤、波长interrogation reader、温控与液体处理单元，实时记录DMR或FRET信号。
中文摘要
GPR35是一种孤儿G蛋白偶联受体，其内源性激动剂长期存在争议。本研究以含羧基和/或儿茶酚基团的酪氨酸代谢中间物为候选，利用基于无标记光学生物传感器的全细胞动态质量重分布（DMR）检测，在天然表达GPR35的HT-29细胞中筛选其激动剂活性，并通过β-arrestin易位、ERK磷酸化和受体内化等分子实验进行验证。结果显示，5,6-二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA）、3,3',5'-三碘甲状腺原氨酸（reverse T3）、3,3',5-三碘甲状腺原氨酸（T3）、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸（gentisate）、迷迭香酸（rosmarinate）和3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine）均可激活GPR35；二氢咖啡酸、DOPAC和DHPG也表现出激动剂活性。SPB05142可剂量依赖性抑制多数激动剂诱导的DMR信号，提示其特异性。结果表明多种酪氨酸代谢物是GPR35的替代内源性配体，GPR35可能成为治疗酪氨酸代谢异常相关疾病的可药靶点。
英文摘要
Both kynurenic acid and 2-acyl lysophosphatidic acid have been postulated to be the endogenous agonists of GPR35. However, controversy remains whether alternative endogenous agonists exist. The molecular targets accounted for many nongenomic actions of thyroid hormones are mostly unknown. Here we report the agonist activity of multiple tyrosine metabolites at the GPR35. Tyrosine metabolism intermediates that contain carboxylic acid and/or catechol functional groups were first selected. Whole cell dynamic mass redistribution (DMR) assays enabled by label-free optical biosensor were then used to characterize their agonist activity in native HT-29. Molecular assays including β-arrestin translocation, ERK phosphorylation and receptor internalization confirmed that GPR35 functions as a receptor for 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, 3,3',5'-triiodothyronine, 3,3',5-triiodothyronine, gentisate, rosmarinate, and 3-nitrotyrosine. These results suggest that multiple tyrosine metabolites are alternative endogenous ligands of GPR35, and GPR35 may represent a druggable target for treating certain diseases associated with abnormality of tyrosine metabolism.