组成图示
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传感器类型
压电(QCM)生物传感器
检测对象
可溶性淀粉样前体蛋白/肽（bovine insulin、human α-synuclein、Aβ(1-42)、PI3K-SH3、lysozyme、β-lactoglobulin等），样品基质为缓冲液或酸性溶液（PBS、HCl pH 2）
检测原理
QCM传感器由金涂层压电石英晶体构成，在交变电场下以剪切模振动，共振频率与表面质量相关。先将预生长淀粉样种子纤维通过MUA/EDC/NHS酰胺偶联或含硫修饰后金-硫键共价固定，并用乙醇胺或m-PEG thiol封闭剩余表面，抑制非特异性吸附。随后引入可溶性淀粉样前体蛋白/肽，单体选择性结合到表面种子纤维末端并使其延长。纤维延长使表面质量增加，同时纤维网络粗糙度升高、结合水增多，增强与液相的耦合，并因粘弹性不能完全跟随振动，导致共振频率下降和耗散变化。在单体消耗可忽略时，频率随时间近似线性下降，斜率反映延长速率，并随单体浓度、温度、离子强度或小分子抑制剂改变。AFM成像用于校准种子密度和长度增量，将频率变化转换为绝对质量或分子速率。
检测灵敏度
Sauerbrey mass sensitivity: 17.7 ng/Hz；可检测频率变化率: 3 Hz/h；频率变化率范围: <0.05 to >20 Hz/min；示例斜率: 0.96 ± 0.01 Hz/min；质量灵敏度系数: 1.4–10 ng/Hz；胰岛素分子速率常数: 1350–9630 M-1s-1
效应效果
该方法可重复使用同一表面固定种子纤维，直接比较不同条件下的延长速率。五次重复胰岛素体系频率变化率为0.96±0.01 Hz/min，重现性优于10%；稳定基线可检测约3 Hz/h，速率覆盖超过四个数量级。无种子对照排除非特异性吸附，AFM成像确认种子数量、长度增加并排除无定形聚集。绝对速率经AFM校准，质量灵敏度系数为1.4–10 ng/Hz，低于Sauerbrey值17.7 ng/Hz，表明结合水/界面耦合贡献；据此估算胰岛素延长分子速率常数为1350–9630 M-1s-1。传感器可用7 M NaOH 80°C清洗去除>95%蛋白，UV/臭氧10 min去除SAM后重复使用，适用于聚集机制研究和抑制剂筛选。
传感器的构成
- 基底/换能器：金涂层石英晶体微天平（QSX 301，5 MHz，Sauerbrey 17.7 ng/Hz），金层作电极并支持硫键固定
- 修饰层：巯基十一烷酸（MUA）自组装单分子层（SAM），经 EDC/NHS 活化用于酰胺偶联
- 修饰层：甲氧基封端聚乙二醇硫醇（m-PEG thiol）SAM，用于封闭裸露金表面
- 识别元件：预生长淀粉样种子纤维（insulin、α-synuclein、Aβ(1-42)、PI3K-SH3等），共价固定于表面作为延长模板
- 识别元件修饰：2-亚氨基硫烷（Traut's reagent）或胱胺（cystamine）引入含硫基团，使纤维可结合金表面
- 封闭剂：乙醇胺（ethanolamine）封闭活化 MUA；剩余胱胺可形成 SAM 封闭
- 信号标记物：无外源标记，可溶性淀粉样前体蛋白/肽结合到种子纤维末端，质量增加产生信号
- 读出层：QCM-D 仪器监测共振频率与耗散，频率下降反映纤维延长
中文摘要
淀粉样蛋白聚集动力学研究有助于理解其自由能景观，并为阿尔茨海默病、帕金森病和2型糖尿病等相关疾病寻找强效抑制剂提供关键依据。近年来，基于表面等离子共振（SPR）和石英晶体微天平（QCM）的表面结合生物传感器方法已成为测定淀粉样形成动力学的重要工具。本章重点介绍如何利用QCM技术实时监测淀粉样纤维的延长过程，并研究温度、离子强度和小分子等外部因素对淀粉样生长动力学的影响。方法的核心是将预生长的淀粉样种子纤维共价、不可逆地固定于金涂层QCM传感器表面，随后封闭剩余表面，再引入可溶性淀粉样前体蛋白或肽。随着单体在纤维末端结合并延长，传感器表面质量增加，共振频率发生可重复、可定量的下降。通过监测频率随时间的线性变化，可在极宽速率范围内获得高精度动力学数据，并结合原子力显微镜（AFM）成像校准种子数量与纤维长度变化，从而区分纤维延长与非特异性吸附，为聚集机制研究和抑制剂筛选提供可靠手段。
英文摘要
Kinetic measurements of amyloid growth provide insight into the free energy landscape of this supramolecular process and are crucial in the search for potent inhibitors of the main disorders with which it is associated, including Alzheimer's and Parkinson's diseases and Type II diabetes. In recent years, a new class of surface-bound biosensor assays, e.g., those based on surface plasmon resonance (SPR) and the quartz crystal microbalance (QCM) have been established as extremely valuable tools for kinetic measurements of amyloid formation. Here we describe detailed protocols of how QCM techniques can be used to monitor the elongation of amyloid fibrils in real time and to study the influence of external factors on the kinetics of amyloid growth with unprecedented accuracy.