组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
Wnt/β-catenin 信号通路活性（Wnt/β-catenin signaling activity）；样品基质：斑马鱼活体胚胎、幼鱼与成鱼组织（CNS 血管、感觉器官、心脏瓣膜、神经嵴来源细胞、再生鳍）
检测原理
该转基因生物传感器以斑马鱼活体组织为基底，将 7 个 TCF/LEF 结合位点串联的 Xenopus siamois 最小启动子（7xTCF-Xla.Siam）整合入基因组。当 Wnt 配体结合 Frizzled/LRP 受体后，β-catenin 降解复合体被抑制，β-catenin 稳定并进入细胞核，与 TCF/LEF 转录因子结合，启动 eGFP 或 mCherry 报告基因转录。荧光蛋白积累使局部荧光强度随 Wnt/β-catenin 通路活性升高而增强，经共聚焦或表观荧光显微镜成像并由 ImageJ 定量。7 个 TCF 重复和长半衰期荧光蛋白提供转录与时间积分放大；热激 Wnt8a/Dkk1 及 BIO、LiCl、alsterpaullone、IWR-1 等小分子可药理学增强或抑制信号，用于验证和筛选。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
TCFsiam 比 Tg(TOP:GFP)w25 更敏感，可检出后部中胚层、耳囊和侧线原基等 TOPdGFP 未显示的表达域；Dkk1 抑制后报告基因恢复比 Tg(TOP:GFP)w25 早约 8 h（后者约 12 h 后检出）。apc 突变背景下表达上调，lef1 缺失使眼、上丘、下丘脑、侧线原基和尾部体节表达降低，tcf3a/tcf4 单突变无显著差异。5 mM alsterpaullone 36 h、0.1 M LiCl 36 h、5 mM BIO 24–48 hpf 增强鳃弓、心脏、侧线表达，10 mM IWR-1 24 h 降低上丘、胸鳍和心脏表达。再生鳍 24 hpa 检出 mCherry RNA，48 hpa 出现荧光，72 hpa 显著增强；1 年成鱼仍可见脑血管网络表达。
传感器的构成
- 遗传识别元件：7xTCF/LEF 结合位点串联于 Xenopus siamois 最小启动子（Xla.Siam）上游，识别 Wnt/β-catenin/TCF 转录活性
- 报告信号元件：eGFP 或 mCherry（nlsmCherry）荧光蛋白，其表达量作为 Wnt 通路活性的荧光读出
- 载体与转座系统：Tol2 转座子目的载体 pTol2pa、Gateway 载体 pDONR221 及体外合成 transposase mRNA，用于将报告盒整合入斑马鱼基因组
- 活体传感基质：斑马鱼胚胎、幼鱼与成鱼组织（CNS 血管、感觉器官、心脏瓣膜、神经嵴来源细胞、再生鳍）
- 通路验证与调节元件：热激诱导 Wnt8a-GFP（Tg(hsp70l:wnt8a-GFP)w34）与 Dkk1-GFP（Tg(hsp70l:dkk1-GFP)w32），以及 BIO、alsterpaullone、LiCl、IWR-1 小分子
- 光学读出系统：共聚焦显微镜/表观荧光显微镜与 ImageJ 软件，用于活体成像和荧光强度定量
中文摘要
在细胞迁移、分化与形态发生过程中，能够解析特定细胞信号事件在活体内时空激活的分子工具对发育细胞生物学具有重要意义。本文报道了两种用于 Wnt/β-catenin 信号通路的转基因报告品系 TCFsiam 的构建、验证与应用，并证明它们是可靠且敏感的 Wnt 生物传感器，可用于活体研究。结果显示，这些品系能在多种细胞背景下敏感检测 Wnt/β-catenin 通路活性，从感觉器官到心脏瓣膜模式形成均有表达。作者进一步提供证据表明，Wnt/β-catenin 活性参与斑马鱼中枢神经系统血管网络的形成与维持，sox10 神经嵴来源细胞在该血管网络上迁移和增殖。最后，这些转基因品系可用于筛选调节 Wnt 信号的化合物、评估组织再生以及评价潜在的 Wnt/β-catenin 遗传调节因子。
英文摘要
The creation of molecular tools able to unravel in vivo spatiotemporal activation of specific cell signaling events during cell migration, differentiation and morphogenesis is of great relevance to developmental cell biology. Here, we describe the generation, validation and applications of two transgenic reporter lines for Wnt/β-catenin signaling, named TCFsiam, and show that they are reliable and sensitive Wnt biosensors for in vivo studies. We demonstrate that these lines sensitively detect Wnt/β-catenin pathway activity in several cellular contexts, from sensory organs to cardiac valve patterning. We provide evidence that Wnt/β-catenin activity is involved in the formation and maintenance of the zebrafish CNS blood vessel network, on which sox10 neural crest-derived cells migrate and proliferate. We finally show that these transgenic lines allow for screening of Wnt signaling modifying compounds, tissue regeneration assessment as well as evaluation of potential Wnt/β-catenin genetic modulators.