组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
环腺苷酸（cAMP）、蛋白激酶A活性（PKA activity）；样品基质：啮齿动物脑切片神经元（皮层锥体神经元、丘脑内层神经元）
检测原理
该检测基于遗传编码的FRET荧光生物传感器。cAMP结合Epac1-camps或Epac2-camps300的cAMP结合域后，探针构象改变，CFP向YFP的FRET效率变化，表现为F480/F535发射比改变，从而反映cAMP浓度。PKA磷酸化AKAR2.2或AKAR3中的PKA特异性底物后，磷酸氨基酸结合域发生构象重排，增强CFP-YFP FRET，报告PKA活性。NLS可将AKAR2.2靶向细胞核，实现核内PKA成像。同时，膜片钳记录慢后超极化钾电流IsAHP作为膜水平PKA磷酸化读出：PKA磷酸化钾通道使其关闭，IsAHP减小、膜去极化。PDE4将cAMP降解为AMP，rolipram抑制PDE4可解除对cAMP/PKA信号的负反馈，增强细树突和膜水平响应。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或R^2；原文报告cAMP传感器灵敏度：Epac1-camps 2 μM，Epac2-camps300 300 nM。
效应效果
该方法可在单个活神经元中同时获得膜、胞浆和核水平的PKA/cAMP动态信息。电生理IsAHP记录时间分辨率低于1秒；PKA信号在膜上约0.5分钟达最大，胞浆约2.5分钟缓慢上升且仅部分激活，进入细胞核超过10分钟。Epac探针报告cAMP，AKAR探针报告PKA磷酸化；Epac1-camps对ISO无显著信号，Epac2-camps300可检测。100 nM rolipram立即降低IsAHP，并在皮层锥体神经元细顶树突增强cAMP/PKA信号，但整体胞浆cAMP不增加，说明PDE4介导亚细胞区室化。β-肾上腺素能响应幅度在PDE4抑制下增大。作者认为该成像可用于研究PDE4抑制剂在神经精神疾病中的作用。
传感器的构成
- 递送载体：Sindbis virus，将生物传感器基因导入啮齿动物脑切片神经元
- 识别元件：Epac1-camps/Epac2-camps300的cAMP结合域，结合cAMP并引起构象变化
- 识别元件：AKAR2.2/AKAR3的磷酸氨基酸结合域与PKA特异性底物，响应PKA磷酸化
- 荧光换能层：CFP与YFP荧光蛋白对，通过FRET变化报告cAMP或PKA活性
- 定位元件：NLS（核定位信号）融合于AKAR2.2 C端，将PKA传感器靶向细胞核
- 成像基底：啮齿动物脑切片神经元，提供膜、胞浆和细胞核区室
- 读出系统：宽场或双光子显微镜，记录F480/F535发射比
中文摘要
本研究在啮齿动物脑切片中结合电生理记录与新型荧光生物传感器成像，实时监测单个神经元内蛋白激酶A（PKA）的激活。电生理以慢后超极化钾电流（I_sAHP）作为膜水平PKA磷酸化事件的指标；生物传感器包括基于Epac的cAMP探针（Epac1-camps、Epac2-camps300）和基于AKAR的PKA活性探针（AKAR2.2、AKAR3），通过CFP/YFP荧光共振能量转移（FRET）报告cAMP浓度或PKA磷酸化变化。结果显示，PKA信号先于约半分钟在膜上快速达到最大激活，随后约2.5分钟在胞浆中缓慢上升并仅部分激活，进入细胞核则需超过10分钟。研究进一步表明，神经元几何形状与磷酸二酯酶活性（主要是rolipram敏感的PDE4）共同决定cAMP在亚细胞区室中的功能分隔，为理解神经调质信号整合及PDE4抑制剂作用机制提供依据。
英文摘要
Electrophysiological recordings (using the slow-AHP potassium current) together with novel biosensor imaging methods (with AKAR and Epac sensors) were used in preparations of rodent brain slices to record PKA activation in real time and in individual neurons. The experiments revealed the propagation of the PKA signal from the membrane to the cytosol and eventually to the nucleus. The experiments show how the geometry of the neurons combined with phosphodiesterase activities (mostly rolipram-sensitive PDE4) contributes to a functional compartmentation of the cAMP in subcellular domains.