组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
重组人整合素 α1β1 的 α1 I 域（α1 I domain）；样品基质为含 Mg2+ 的 Tris-HCl/NaCl/BSA 缓冲液中的重组蛋白溶液；竞争实验中也检测其与胶原 IV（collagen IV）包被表面的结合。
检测原理
胶原三螺旋肽 GLOGEN、GFOGER 或 GVOGEA 先包被于 TiO Bind 传感器板，BSA 封闭后置于含 2 mM MgCl2 的 Tris 缓冲液中。重组 α1 I 域通过 MIDAS 位点中的二价阳离子与肽中谷氨酸/天冬氨酸羧基配位而发生 Mg2+ 依赖结合。结合到表面的 α1 I 域质量改变局部光学厚度，使反射光峰波长发生偏移，ΔPWV 与结合质量成正比，因此信号随 α1 I 域浓度升高而增大并趋于饱和。竞争实验中，游离 GLOGEN/GFOGER 先与 α1 I 域结合，占据其配体结合位点，使到达表面的 α1 I 域减少，ΔPWV 下降，从而估算 IC50/Kd。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。报告结合/竞争参数：Kd(GLOGEN)≈13 ± 1.9 μM；Kd(GFOGER)≈53 ± 6 μM；Kd(GVOGEA)≈140 ± 37 μM；IC50(GLOGEN)≈2.8 μM；IC50(GFOGER)≈90 μM。
效应效果
该检测具有明显整合素选择性：GVOGEA 仅被 α1β1 识别，不被 α2 I 域、表达 α2β1 或 α11β1 的 C2C12 细胞结合；GLOGEN 对 α1 I 域亲和高于 GFOGER。Mg2+ 依赖结合可被 EDTA 消除；抗 α1 抗体以 IC50 40 ng/ml 剂量依赖阻断 PC12 与 III-7 结合，180 ng/ml 近完全阻断。PMA 激活 Rugli 细胞后对 GVOGEA 粘附升至与 II-27 相当。生物传感器测得 GLOGEN Kd≈13 μM，GFOGER≈53 μM，GVOGEA≈140 μM；GLOGEN 竞争胶原 IV 的 IC50≈2.8 μM，GFOGER≈90 μM，支持 GFOGER 偏向 α2β1、GLOGEN 为 α1β1 高亲和位点。
传感器的构成
- 基底/换能器：SRU Biosystems 96-well TiO Bind 生物传感器板，提供反射光峰波长（ΔPWV）光学换能表面。
- 识别/配体捕获层：胶原三螺旋肽 GLOGEN、GFOGER 或 GVOGEA（20 μg/ml，醋酸缓冲液 pH 5.0 包被），作为 α1 I 域结合配体。
- 封闭层：BSA（2 mg/ml）包被后封闭非特异结合位点。
- 结合缓冲环境：50 mM Tris-HCl、140 mM NaCl、pH 7.4，含 2 mM MgCl2 与 0.5 mg/ml BSA，维持 Mg2+ 依赖 MIDAS 结合。
- 分析物/结合分子：重组人 α1 I 域（0.17 μM 固定浓度或 0–60 μM 梯度），作为被测整合素配体结合域。
- 竞争/调节分子：溶液态 GLOGEN 或 GFOGER 肽，与 α1 I 域预孵育后竞争结合固定肽。
- 信号读出：无外源标记，结合质量改变反射峰波长，ΔPWV 与结合分子质量成正比。
中文摘要
胶原含有 GxOGEx1 整合素结合基序，但其身份与特异性尚不明确。本研究利用胶原 II 和 III 工具肽，通过固相结合实验与实时无标记细胞粘附实验，检测重组人 α1 I 域、PC12 细胞及 Rugli 细胞对胶原肽的结合。α1 I 域在 Mg2+ 存在下按 III-7（GLOGEN）、II-28（GFOGER）、II-7/II-8（GLOGER）、II-18（GAOGER）、III-4（GROGER）顺序结合；抗体阻断证实 PC12 与 III-7 的结合由 α1β1 介导。GVOGEA 对静息 PC12 结合较弱，但对 PMA 激活的 Rugli 细胞或激活型 α1 I 域结合较强，而不结合 α2 I 域或表达 α2β1/α11β1 的 C2C12 细胞，显示 α1β1 特异性。生物传感器竞争实验表明，GLOGEN 可竞争性抑制 α1 I 域与胶原 IV 结合（IC50 约 3 μM），而 GFOGER 较弱（IC50 约 90 μM）。结果确立 GLOGEN 为 α1β1 高亲和胶原位点，GVOGEA 为 α1β1 特异性位点。
英文摘要
Integrins are well characterized cell surface receptors for extracellular matrix proteins. Mapping integrin-binding sites within the fibrillar collagens identified GFOGER as a high affinity site recognized by α2β1, but with lower affinity for α1β1. Here, to identify specific ligands for α1β1, we examined binding of the recombinant human α1 I domain, the rat pheochromocytoma cell line (PC12), and the rat glioma Rugli cell line to our collagen Toolkit II and III peptides using solid-phase and real-time label-free adhesion assays. We observed Mg(2+)-dependent binding of the α1 I domain to the peptides in the following rank order: III-7 (GLOGEN), II-28 (GFOGER), II-7 and II-8 (GLOGER), II-18 (GAOGER), III-4 (GROGER). PC12 cells showed a similar profile. Using antibody blockade, we confirmed that binding of PC12 cells to peptide III-7 was mediated by integrin α1β1. We also identified a new α1β1-binding activity within peptide II-27. The sequence GVOGEA bound weakly to PC12 cells and strongly to activated Rugli cells or to an activated α1 I domain, but not to the α2 I domain or to C2C12 cells expressing α2β1 or α11β1. Thus, GVOGEA is specific for α1β1. Although recognized by both α2β1 and α11β1, GLOGEN is a better ligand for α1β1 compared with GFOGER. Finally, using biosensor assays, we show that although GLOGEN is able to compete for the α1 I domain from collagen IV (IC(50) ∼3 μm), GFOGER is much less potent (IC(50) ∼90 μm), as shown previously. These data confirm the selectivity of GFOGER for α2β1 and establish GLOGEN as a high affinity site for α1β1.