组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
镉离子（Cd2+）、锌离子（Zn2+）、铅离子（Pb2+）、铜离子（Cu2+，实验中还原为 Cu+）；样品基质为重组 NcMT3 蛋白溶液/缓冲液（HEPES/NaCl/β-巯基乙醇，质谱用醋酸铵缓冲液）。
检测原理
NcMT3 通过 11 个半胱氨酸残基与 Cd2+、Zn2+、Pb2+ 等阳离子配位，形成金属-硫醇盐簇；质谱显示不同金属形成 3–5 个 Cd、4–5 个 Zn、4–6 个 Pb 等化学计量。将 NcMT3 共价固定于锗 ATR 表面后，ATR-FTIR 利用倏逝波探测表面蛋白的酰胺 I（约 1651 cm-1）和酰胺 II（约 1535 cm-1）振动。金属结合或 EDTA 去除金属会改变蛋白构象及酰胺键氢键环境，从而引起红外吸收强度或位置变化。由于 NcMT3 缺乏周期性二级结构，金属去除后酰胺 I 仍为宽峰，未出现显著二级结构变化，说明其结合主要依赖三级折叠微调而非形成新的 α 螺旋或 β 折叠。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
质谱显示 NcMT3 对 Cd2+、Zn2+、Pb2+ 有明显结合，化学计量分别为 3–5、4–5 和 4–6；Mn2+ 仅结合 1 个，Cu(I) 未检测到特异结合，且未检出 S2-，提示结合主要由 11 个 Cys 完成。ATR-FTIR、远紫外 CD 和氢/氘交换均表明蛋白缺乏周期性二级结构，酰胺 I 位于 1651 cm-1，半高宽约 58 cm-1，二级结构估算为 α 螺旋 4%、β 折叠 11%、无规卷曲 55%、β 转角 3%。在 BIA-ATR 表面，EDTA 去除金属后未观察到显著结构变化，说明表面 PEG 环境可稳定 apo 蛋白。作者认为 NcMT3 可能参与 Cd 和 Pb 解毒，Zn 作用较弱，并揭示植物 III 型 MT 的无序结构特征。
传感器的构成
- 基底/换能器：锗 ATR 内反射元件（Ge ATR crystal/plate），产生倏逝波并用于 ATR-FTIR 信号采集。
- 封闭/抗非特异层：聚乙二醇（PEG）硅烷化层，减少蛋白非特异吸附和表面变性。
- 共价连接层：O-琥珀酰亚胺基 4-(p-叠氮苯基)丁酸酯（O-succinimidyl 4-(p-azidophenyl)butanoate）光接枝活化酯，与蛋白伯胺共价结合。
- 固定蛋白层：重组 NcMT3 金属硫蛋白（NcMT3），通过 N 端或赖氨酸 ε-NH2 固定于表面。
- 信号标记物：无外源标记，蛋白自身酰胺 I（amide I）和酰胺 II（amide II）红外吸收作为信号。
- 样品流路：密封流动池（sealed flow chamber），通缓冲液、EDTA 或金属离子溶液以改变金属状态。
- 检测仪器：Bruker IFS55 FTIR 光谱仪配 MCT 检测器，记录 ATR-FTIR 谱。
中文摘要
金属硫蛋白（MT）是一类低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质，能以极高亲和力结合重金属。植物 MT 与动物 MT 不同，通常由两个短的富含半胱氨酸末端结构域和一个约 30 个残基的无半胱氨酸连接区组成。与动物 MT 相比，植物 MT 的三维结构数据严重缺乏。本研究表达并纯化了来自重金属超富集植物 Noccaea caerulescens 的 III 型 MT（NcMT3）。质谱分析表明，该蛋白可结合 Cd2+、Cu2+、Zn2+ 和 Pb2+ 等多种阳离子，并形成不同金属化学计量。远紫外圆二色性、红外光谱和氢/氘交换动力学均显示，NcMT3 完全缺乏周期性二级结构。当蛋白共价固定于 BIA-ATR 生物传感器表面时，去除金属离子后未观察到显著结构变化。这些结果揭示了植物 III 型 MT 独特的金属结合与无序结构特征。
英文摘要
Metallothioneins (MT) are low molecular weight proteins with cysteine-rich sequences that bind heavy metals with remarkably high affinities. Plant MTs differ from animal ones by a peculiar amino acid sequence organization consisting of two short Cys-rich terminal domains (containing from 4 to 8 Cys each) linked by a Cys free region of about 30 residues. In contrast with the current knowledge on the 3D structure of animal MTs, there is a striking lack of structural data on plant MTs. We have expressed and purified a type III MT from Noccaea caerulescens (previously Thlaspi caerulescens). This protein is able to bind a variety of cations including Cd(2+), Cu(2+), Zn(2+) and Pb(2+), with different stoichiometries as shown by mass spectrometry. The protein displays a complete absence of periodic secondary structures as measured by far-UV circular dichroism, infrared spectroscopy and hydrogen/deuterium exchange kinetics. When attached onto a BIA-ATR biosensor, no significant structural change was observed upon removing the metal ions.