组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
PqsD酶催化活性（PqsD catalytic activity）、HHQ（2-heptyl-4(1H)-quinolone）；样品基质：SPR芯片表面缓冲液及流出液
检测原理
PqsD经EDC/NHS活化后共价固定于SPR芯片CM葡聚糖基质中。先注入ACoA，其邻氨基苯甲酸部分共价结合PqsD活性中心Cys112，界面质量增加，SPR信号上升并在解离期保持；随后注入β-K，与已结合的邻氨基苯甲酸发生缩合反应生成HHQ。HHQ从活性位点释放，使界面质量回落，SPR基线下降至初始水平。SPR以无标记方式实时反映底物转化引起的质量变化；流出液收集后经UHPLC-MS2按保留时间和碎片谱确认HHQ。信号变化与酶催化活性相关，产物量可定量，无需外源标记或信号放大。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
ACoA注入后SPR信号明显上升且解离期未回到基线，DRU为15，证明邻氨基苯甲酸共价结合；β-K注入后基线降至初始0 RU，表明产物释放。流出液UHPLC-MS2确认芯片上生成HHQ，产率为147 pmol/pmol PqsD；相同条件下溶液中PqsD产率为307 pmol/pmol，固定化酶活性约为溶液酶的2倍低。固定化配体在16天内保持可检测活性，第5天前可定量生成HHQ，16天后仍检测到HHQ信号。作者认为该方法可替代抗体或已知结合物作为阳性对照，用于SPR芯片表面功能活性与结合位点可及性评估。
传感器的构成
- 基底/换能器：SPR生物传感器芯片表面，用于表面等离子共振换能（原文未明确金属层材料）
- 表面活化层：EDC/NHS，活化芯片表面羧基以形成共价固定位点
- 固定化基质：carboxymethyl dextran（CM dextran）基质，在pH 4.5下承载并共价固定PqsD
- 识别/催化元件：PqsD酶，作为固定化配体催化ACoA与β-K缩合生成HHQ
- 底物/分析物：邻氨基苯甲酰辅酶A（ACoA）和β-酮癸酸（β-K），依次注入并与PqsD作用
- 信号/产物：HHQ（2-heptyl-4(1H)-quinolone），酶催化产物，其释放引起SPR基线下降并被质谱检测
- 读出系统：SPR仪与UHPLC-MS2，SPR实时监测界面质量变化，UHPLC-MS2确认HHQ生成
中文摘要
表面等离子共振（SPR）是一种无标记生物传感技术，近年来在药物发现中用于实时监测分子相互作用。固定化目标蛋白后，其表面功能活性是否保留直接影响检测质量，因此需要验证芯片上配体的催化活性。本研究以铜绿假单胞菌群体感应信号分子PQS生物合成途径中的双底物酶PqsD为模型，将其通过EDC/NHS活化后共价固定于SPR芯片的羧甲基葡聚糖基质中。依次注入底物邻氨基苯甲酰辅酶A（ACoA）和β-酮癸酸（β-K），通过SPR信号变化监测底物转化：ACoA结合使信号上升并保持，β-K注入后产物HHQ释放使基线下降。流出液经超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS2）检测，确认芯片上生成HHQ。该方法可用于评估固定化配体的表面活性，为SPR检测开发提供功能验证手段。
英文摘要
Surface plasmon resonance (SPR) as a label-free biosensor technique has become an important tool in drug discovery campaigns during the last couple of years. For good assay performance, it is of high interest to verify the functional activity on the immobilization of the target protein on the chip. This study illustrates the verification of the catalytic activity of the drug target protein PqsD by monitoring substrate conversion as a decrease in SPR signal and product detection by ultra high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UHPLC-MS(2)). This assay would be applicable to control surface activity of immobilized ligands.