组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
氧消耗（oxygen consumption）、细胞外酸化率（extracellular acidification rate）、细胞阻抗/黏附（cell impedance/adhesion）；样品基质：培养细胞（HeLa、HEK293T、H1299）于 DMEM 培养基。
检测原理
瞬时转染使 SIRT3 在活细胞内表达，SIRT3 作为线粒体去乙酰化酶通过去乙酰化呼吸链复合物 I、促进 PGC-1α 表达以及调控乙酰辅酶A合成酶和 GDH 等途径改变细胞能量代谢。SIRT3 野生型过表达增强线粒体呼吸，使细胞周围氧浓度下降；糖酵解及代谢副产物改变细胞外 pH；细胞黏附、形态和膜完整性改变 IDES 电极阻抗。Clark 型氧传感器将氧浓度变化转换为电信号，ISFET 将 pH 变化转换为电位/电流信号，IDES 将阻抗变化转换为电信号。Bionas 2500 系统周期性交换低 FBS、低葡萄糖、1 mM HEPES 缓冲 DMEM，连续记录氧消耗、酸化率和阻抗，从而以时间分辨方式反映 SIRT3 表达水平与细胞代谢状态的变化。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该方法在活细胞中实现非终点、实时多参数监测。HeLa 经 Nanofectin 或 Amaxa nucleofection 转染效率分别为 60–70% 和 50–60%，HEK293T 与 HeLa 最适合长期 Bionas 监测。Western blot 显示 SIRT3 蛋白约 6 h 出现，16–20 h 达最大；呼吸变化较蛋白表达延迟 1–2 h，最大呼吸增加出现在转染后 18–20 h。SIRT3 野生型过表达使呼吸增加最高约 35%，22 h 后比较平均约 40%，糖酵解和阻抗无显著变化；失活突变体与空载/未转染细胞一致。作者指出 Bionas 测量标准偏差约 10%，目标蛋白需引起大于 10% 的代谢变化才易显著。该方法可比较野生型、突变体、SNP 及药物处理下的代谢响应，适用于蛋白功能与代谢调控研究。
传感器的构成
- 基底/换能器芯片：Bionas SC1000 代谢芯片，集成 Clark 型氧传感器、ISFET pH 传感器和 IDES 阻抗电极，用于原位多参数检测。
- 表面修饰层：poly-D-lysine 涂覆芯片表面，促进细胞黏附与铺展。
- 识别元件：HeLa、HEK293T 或 H1299 活细胞，瞬时转染 SIRT3-wt、SIRT3-H248Y 或空载，作为代谢响应识别单元。
- 信号标记物：无外源标记物，细胞呼吸耗氧、糖酵解酸化及细胞膜阻抗变化直接产生信号。
- 流动介质：低 FBS、低葡萄糖、1 mM HEPES 缓冲 DMEM，维持细胞代谢并周期性交换以稳定基线。
- 读出系统：Bionas 2500 分析系统，连续监测氧消耗、酸化率和阻抗，输出代谢动力学曲线。
中文摘要
在尽可能接近活体条件的环境中分析和可视化研究数据是当前科学研究面临的最具挑战性的任务之一。目前，蛋白质功能对细胞代谢的影响通常通过一系列终点分析来评估，只能近似估计特定效应的发展过程。本研究展示了瞬时转染与生物传感器芯片系统相结合，可在活细胞中实时监测代谢相关参数，如氧消耗、酸化率和细胞黏附，从而分析特定蛋白对细胞代谢的影响。此外，该方法能够在线监测从转染到最大过表达期间，代谢调控蛋白表达水平变化所引起的代谢变化时间过程。本文以瞬时过表达 SIRT3 去乙酰化酶评估该方法，SIRT3 是线粒体中调控能量代谢、代谢疾病、癌症和衰老的关键元件。
英文摘要
The analysis and visualisation of research data in an environment which is most similar to living conditions belong to the most challenging claims of present scientific research endeavours. To date, the effect of protein function on cell metabolism is most commonly assessed from a series of end point analyses, which finally allows an approximate estimation on how a specific effect takes its course. In the study presented herein, we demonstrate how the combination of transient transfection and a biosensor chip system gives the opportunity to analyse the effect of a specific protein on cell metabolism in living cells through real-time monitoring of metabolically relevant parameters, such as oxygen consumption, acidification rate and cell adhesion. In addition, this method allows online monitoring of the time course of metabolic changes due to changes in expression levels of metabolic regulative proteins from the time of transfection to maximum overexpression. The methodology presented herein was assessed for the transient overexpression of the sirtuin deacetylase SIRT3, a mitochondrial key element in the regulation of energy metabolism, metabolic disease, cancer and ageing.