组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
免疫球蛋白E（IgE）；样品基质：缓冲液、20倍稀释人血清
检测原理
在无IgE时，RP2和MB均折叠为发夹结构，37-mer片段被掩蔽，MB保持FAM-DABCYL猝灭态，背景信号低。加入IgE后，IgE与RP2中的抗IgE适配体序列特异性结合，诱导RP2发生变构，释放37-mer片段。该片段与MB部分杂交，打开MB发夹并形成Nt.BbvCI识别双链位点。Nt.BbvCI切割MB，使FAM与DABCYL分离，产生荧光。切割后，RP2-IgE复合物仍携带37-mer片段，可继续与另一MB杂交并触发下一轮酶切，实现酶促循环放大。IgE浓度越高，被循环切割的MB越多，F/F0或荧光增强越大，最终由荧光分光光度计读出。
检测灵敏度
LOD: 5 pM；线性范围: 10 pM–20 nM；无酶对照LOD: 1 nM
效应效果
该传感器对IgE具有较高选择性，在5 nM浓度下，IgG、HSA、Azocasein、PDGF-BB、C4和Albumin等潜在干扰蛋白均未引起显著荧光增强。与无Nt.BbvCI的对照体系相比，酶促循环放大使检出限由1 nM降至5 pM，灵敏度提高约两个数量级，优于此前报道的IgE适配体传感器。在20倍稀释人血清中加标检测（20 pM、200 pM、2 nM、20 nM）时，荧光响应与缓冲液体系相近，仅背景略有升高，表明其可用于复杂生物样品。作者认为该策略设计简单、操作简便，可作为多种靶标高灵敏生物传感器的通用平台。
传感器的构成
- 识别探针：RP2（含抗IgE适配体序列与37-mer片段，发夹结构，识别IgE并释放37-mer）
- 报告探针：MB（5′-FAM-CCACGAGTCAGTGTCCTCAGCGTGG-3′-DABCYL，发夹结构，含Nt.BbvCI切割位点）
- 酶促放大元件：切口内切酶Nt.BbvCI（识别MB与37-mer形成的双链并切割MB，实现循环放大）
- 反应缓冲体系：NEB buffer 4（20 mM Tris-Ac、10 mM Mg(Ac)2、50 mM KAc、1 mM DTT、pH 7.9，维持酶活性）
- 荧光读出装置：Hitachi F-7000荧光分光光度计（激发494 nm，发射505–600 nm，检测FAM荧光）
中文摘要
本文开发了一种基于切口内切酶的通用放大策略，用于构建高灵敏荧光适配体传感器。该策略将识别探针和报告探针均设计为发夹结构，以降低背景荧光，并利用切口内切酶实现目标触发的酶促循环放大。为验证可行性，以免疫球蛋白E（IgE）为模型靶标。加入IgE后，IgE与适配体序列特异性结合形成复合物，诱导识别探针发生构象变化并释放37-mer片段；该片段与分子信标（MB）探针部分杂交，打开MB发夹结构并形成Nt.BbvCI识别位点。在Nt.BbvCI作用下，MB被切割为两部分，使荧光基团FAM与猝灭基团DABCYL分离，产生荧光信号。随后，携带37-mer片段的RP-IgE复合物可继续与另一MB杂交并触发第二轮切割，从而实现荧光信号累积。在最优条件下，该传感器对IgE的检出限为5 pM，并成功用于复杂生物样品中IgE的检测，结果令人满意。
英文摘要
A universal amplified sensing strategy based on endonuclease was developed for designing fluorescence aptasensors. By employing hairpin-structured design for both recognition and reporter probes to decrease background signal, and a nicking endonuclease to perform target-triggered enzymatic recycling amplification, the proposed biosensor showed high sensitivity to target protein. To demonstrate the feasibility of the design, immunoglobulin E (IgE) was studied as a model target. Upon the addition of target protein, the specific formation of IgE/aptamer complex induced the releasing of the 37-mer fragment which partially hybridized with the molecular beacon (MB) probe. In the presence of endonuclease Nt.BbvCI, the MB was cleaved into two parts. Then, the released 37-mer fragment hybridized with another MB, and triggered the second cycle of cleavage, leading to an accumulation of fluorescence signals. Under the optimal conditions, a detection limit of 5 pM was obtained. The proposed sensing system was used for detection of IgE in complex biological samples with satisfactory results.