组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
纤维二糖（cellobiose，β-异头物）；间接检测对象：纤维二糖水解酶活性（cellobiohydrolase activity，TrCel7A）。样品基质：不溶纤维素悬浮液（Avicel PH-101、RAC）与 TrCel7A 酶解反应液（50 mM 醋酸钠缓冲液，含 2 mM CaCl2，pH 5）。
检测原理
该传感器采用介质辅助生物电催化。PcCDH 固定在含对苯醌（BQ）的碳糊电极表面，特异性识别并催化 β-纤维二糖（cellobiose）氧化；反应电子经 PcCDH 传递给 BQ，使其还原为对苯二酚（HQ）。在 +0.5 V（vs Ag/AgCl）恒电位下，HQ 在工作电极表面被氧化再生 BQ，形成可循环的氧化还原介质，产生稳态阳极电流。当 TrCel7A 水解不溶纤维素（Avicel 或 RAC）时，释放的 β-纤维二糖进入电极界面，电流随其浓度/释放速率线性增加，因此可实时监测纤维二糖水解酶初始动力学。由于 PcCDH 对 α-异头物基本无活性，且纤维二糖变旋平衡缓慢，校准需按 β-异构体平衡组成校正。无额外化学放大，信号放大来自酶催化与介质循环。
检测灵敏度
LOD: 25 nM；线性范围: 至 25 mM；灵敏度: 6.23 ± 0.01 nA mM−1（电流密度 87.7 mA mM−1 cm−2）；t95% ≈ 3 s
效应效果
传感器对葡萄糖（5–50 mM）无响应，显示对纤维二糖/纤维寡糖 β-异构体选择性。稳态响应在约 5 s 内建立，t95%≈3 s，动态延迟约 1 s，时间分辨率约 1 s、浓度分辨率 25 nM。酶解实验中浓度曲线重现性在 ±5% 以内；通过水解前后两次校准校正酶脱附/失活，提高重现性。与 HPAEC-PAD 基准比较，纤维二糖浓度相关斜率为 0.981，验证了变旋平衡校正和整体性能。作者认为该 CDH 生物传感器可用于纯不溶纤维素底物上纤维二糖水解酶及内切葡聚糖酶的实时动力学、机制与调控研究，并可比较不同酶、变体、底物和条件。
传感器的构成
- 工作电极基底：碳糊电极（CPE），由石墨粉（TGP-7）与液体石蜡组成，提供导电表面并承载介质与酶。
- 电子介质层：对苯醌（BQ）混入碳糊，作为电子介质，被 PcCDH 还原为对苯二酚（HQ）并在电极上氧化产生电流。
- 催化识别元件：Phanerochaete chrysosporium 纤维二糖脱氢酶（PcCDH），特异性催化 β-纤维二糖/纤维寡糖氧化，将电子传递给 BQ。
- 交联固定层：戊二醛（GA）与 PcCDH 交联，并通过物理化学吸附固定在电极表面，提高操作与长期稳定性。
- 表面覆盖层：Nuclepore 聚碳酸酯 Track Etch 膜（孔径 15 nm）及尼龙网/特氟龙管，用于覆盖部分电极并固定膜组件。
- 电化学测量组件：Ag/AgCl 参比电极与铂丝辅助电极，与酶修饰工作电极构成三电极体系，在 +0.5 V 恒电位下读取电流。
中文摘要
本文报道了一种用于连续检测纤维二糖的安培酶生物传感器，并将其作为纤维素酶酶学测定方法。作者表明，来自 Trichoderma reesei 的纤维二糖水解酶 I（Cel7A）作用于半结晶和无定形纤维素底物的初始动力学，可通过基于 Phanerochaete chrysosporium 纤维二糖脱氢酶（CDH）的酶修饰电极直接实时监测。PcCDH 经交联并固定在含介质苯醌的碳糊电极表面；在 +0.5 V（vs Ag/AgCl）恒电位安培法下，记录 CDH 催化纤维二糖反应产生的还原介质对苯二酚的氧化电流。CDH 生物传感器具有高灵敏度（87.7 mA mM−1 cm−2）、低检出限（25 nM）和快速响应（t95%≈3 s），从而可获取不溶纤维素上纤维二糖水解酶的瞬态动力学。酶解过程中传感器响应针对 PcCDH 对 β-异头纤维寡糖的特异性进行了校正，并与 HPLC 验证。作者认为，对纯不溶纤维素底物的定量实时数据将有助于探究纤维素酶解的分子机制。
英文摘要
An amperometric enzyme biosensor for continuous detection of cellobiose has been implemented as an enzyme assay for cellulases. We show that the initial kinetics for cellobiohydrolase I, Cel7A from Trichoderma reesei, acting on different types of cellulose substrates, semi-crystalline and amorphous, can be monitored directly and in real-time by an enzyme-modified electrode based on cellobiose dehydrogenase (CDH) from Phanerochaete chrysosporium (Pc). PcCDH was cross-linked and immobilized on the surface of a carbon paste electrode which contained a mediator, benzoquinone. An oxidation current of the reduced mediator, hydroquinone, produced by the CDH-catalyzed reaction with cellobiose, was recorded under constant-potential amperometry at +0.5 V (vs. Ag/AgCl). The CDH-biosensors showed high sensitivity (87.7 µA mM(-1) cm(-2)), low detection limit (25 nM), and fast response time (t(95%) ≈ 3 s) and this provided experimental access to the transient kinetics of cellobiohydrolases acting on insoluble cellulose. The response from the CDH-biosensor during enzymatic hydrolysis was corrected for the specificity of PcCDH for the β-anomer of cello-oligosaccharides and the approach were validated against HPLC. It is suggested that quantitative, real-time data on pure insoluble cellulose substrates will be useful in attempts to probe the molecular mechanism underlying enzymatic hydrolysis of cellulose.