组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
细胞内过氧化氢（H2O2）、Rac1 活性、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）；样品基质：牛主动脉内皮细胞（BAEC）活细胞及细胞裂解液
检测原理
该文采用基因编码荧光/FRET 生物传感器进行活细胞成像。HyPer2 中的敏感半胱氨酸被 H2O2 氧化后，其荧光发射比值随 H2O2 浓度升高而改变；Raichu-Rac1 在 Rac1 结合 GTP 激活时发生构象变化，增强 CFP 向 YFP 的 FRET 效率；PiPi 结合 PIP2 后改变 FRET 比值，反映局部 PIP2 浓度。Ang-II 结合内皮细胞 AT1 受体后，诱导内源 H2O2 升高并激活 Rac1，进而促进 MARCKS 磷酸化、从膜区转位至胞内并结合肌动蛋白，同时引起局部 PIP2 增加和黏着斑/应力纤维重塑。信号通过显微镜采集荧光或 FRET 比值实时读出，未使用酶催化或核酸扩增等外部放大，主要依赖比值法成像和 siRNA/PEG-过氧化氢酶功能验证。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
研究以 AT1 受体拮抗剂 losartan 阻断 Ang-II 诱导的 MARCKS 磷酸化，显示受体特异性；PEG-过氧化氢酶清除 H2O2 后，Ang-II 诱导的 HyPer2 荧光升高、Raichu-Rac1 FRET 升高、PiPi 检测的局部 PIP2 增加以及 MARCKS 磷酸化均被抑制，表明 H2O2 依赖。siRNA 敲低 Rac1、MARCKS 或 c-Abl 分别阻断 Ang-II/H2O2 诱导的 MARCKS 磷酸化、c-Abl 磷酸化、MARCKS 转位和 vinculin 黏着斑形成，显示通路依赖。实验重复 3–6 次，统计显著性 p<0.05。作者主张该通路为理解 Ang-II 调控内皮细胞骨架、黏附及动脉瘤形成提供机制基础。
传感器的构成
- 细胞基底：牛主动脉内皮细胞（BAEC），作为基因编码荧光传感器表达与 Ang-II 刺激检测平台
- 表达载体：pWPXL 慢病毒载体（EF1α 启动子）及质粒转染体系，用于表达 HyPer2、Raichu-Rac1 和 PiPi 传感器
- 识别元件：HyPer2 基因编码 H2O2 荧光传感器，响应细胞内过氧化氢水平
- 识别元件：Raichu-Rac1 FRET 传感器，响应 Rac1 小 GTPase 活性
- 识别元件：PiPi FRET 传感器，响应磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）局部浓度
- 信号标记物：CFP/YFP 荧光对及 HyPer2 荧光比值，作为 H2O2、Rac1 和 PIP2 变化的光学信号
- 读出装置：Olympus IX81 倒置显微镜、DSU 旋转盘共聚焦系统、Hamamatsu Orca ER 相机和 MetaMorph 软件，用于实时荧光/FRET 比值成像
中文摘要
肉豆蔻酰化丙氨酸富集 C 激酶底物（MARCKS）是调控血管内皮细胞迁移与细胞骨架信号的肌动蛋白结合蛋白，但其在血管紧张素 II（Ang-II）信号中的作用尚不清楚。本研究通过免疫组化、免疫印迹、基因编码荧光生物传感器活细胞成像及 siRNA 敲低等生化与细胞成像方法，发现完整动脉组织中 MARCKS 主要表达于内皮层；在内皮细胞中，Ang-II 经 AT1 受体促进 MARCKS 磷酸化，该过程可被 AT1 受体拮抗剂 losartan 阻断。HyPer2 传感器显示 Ang-II 升高细胞内 H2O2；PEG-过氧化氢酶清除 H2O2 后，Ang-II 诱导的 MARCKS 磷酸化、Rac1 激活和 PIP2 局部增加均被抑制。siRNA 敲低 Rac1 或 MARCKS 可阻断 Ang-II 诱导的 c-Abl 酪氨酸激酶激活并破坏肌动蛋白纤维与黏着斑形成。结果表明，Ang-II 通过依赖 H2O2、Rac1、MARCKS 和 c-Abl 的新通路调控内皮细胞骨架重塑，MARCKS 是 Ang-II 血管内皮反应的关键决定因素。
英文摘要
MARCKS is an actin-binding protein that modulates vascular endothelial cell migration and cytoskeleton signaling (Kalwa, H., and Michel, T. (2011) J. Biol. Chem. 286, 2320-2330). Angiotensin-II is a vasoactive peptide implicated in vascular physiology as well as pathophysiology; the pathways connecting angiotensin-II and cytoskeletal remodeling are incompletely understood. Here we show that MARCKS is expressed in intact arterial preparations, with prominent staining of the endothelium. In endothelial cells, angiotensin-II-promoted MARCKS phosphorylation is abrogated by PEG-catalase, implicating endogenous H(2)O(2) in the angiotensin-II response. Studies using the H(2)O(2) biosensor HyPer2 reveal that angiotensin-II promotes increases in intracellular H(2)O(2). We used a Rac1 FRET biosensor to show that angiotensin-II promotes Rac1 activation that is attenuated by PEG-catalase. siRNA-mediated Rac1 knockdown blocks angiotensin-II-stimulated MARCKS phosphorylation. Cell imaging studies using a phosphoinositide 4,5-bisphosphate (PIP(2)) biosensor revealed that angiotensin-II PIP(2) regulation depends on MARCKS and H(2)O(2). siRNA-mediated knockdown of MARCKS or Rac1 attenuates receptor-mediated activation of the tyrosine kinase c-Abl and disrupts actin fiber formation. These studies establish a critical role for H(2)O(2) in angiotensin-II signaling to the endothelial cytoskeleton in a novel pathway that is critically dependent on MARCKS, Rac1, and c-Abl.