组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
microRNA-21（miR-21/mir21）；样品基质：细胞裂解液总 RNA（MCF-7 乳腺癌细胞、293-HEK 细胞）
检测原理
PGE 经 +1.4 V 电化学活化引入羧基，EDC/NHS 将其转化为琥珀酰亚胺酯，捕获探针（mir21 或含 mir21 总 RNA）通过鸟嘌呤 N7 氨基共价固定。样品中/加入的生物素化 anti-mir21 与固定探针杂交形成双链，使 3' 端生物素暴露；Ex-Ap 通过生物素–Extravidin 高亲和结合到杂交界面。碱性磷酸酶催化 1-萘基磷酸酯水解生成电活性 α-萘酚（a-NAP）。a-NAP 在 +0.23 V vs Ag/AgCl 被氧化，DPV 峰电流随 mir21 含量增加而增大；无杂交时仅有非特异背景。酶催化将单个杂交事件转化为多个电活性产物，实现信号放大。
检测灵敏度
LOD: 6 pmol（酶促 a-NAP 法，细胞裂解液总 RNA）；LOD: 4 pmol（鸟嘌呤氧化法，合成 mir21 RNA）
效应效果
该传感器对 mir21 具有特异性：非互补序列 mir192 以及两种不含 mir21 的 293-HEK 细胞裂解液（NC-1、NC-2）中，探针与“杂交”后 a-NAP 氧化信号几乎相同，表明未发生非特异杂交。酶促 a-NAP 法在细胞裂解液中信号可重复，平均 RSD 为 5%，且能区分 MCF-7 乳腺癌细胞（mir21 上调）与 293-HEK 阴性样品；检测限为 6 pmol。相比之下，鸟嘌呤氧化法在细胞裂解液中仅产生纳安级、不可重复信号，难以区分含/不含 mir21 样品。作者认为该方法比 Northern blotting 更快速、稳健、可重复，可推广至其他癌症组织总 RNA 及其他 miRNA 检测。
传感器的构成
- 工作电极：铅笔石墨电极（PGE，Tombo HB 0.5 mm 石墨芯），作为导电基底与电化学换能器。
- 表面活化层：EDC/NHS 偶联层，将 PGE 电化学活化产生的羧基转化为琥珀酰亚胺酯（-COOSuc），用于探针共价固定。
- 识别元件：捕获探针（合成 mir21 DNA/RNA 或含 mir21 的细胞裂解液总 RNA），通过鸟嘌呤 N7 氨基与 -COOSuc 形成酰胺键固定。
- 靶标标记元件：3' 端生物素标记的互补 anti-mir21（含肌苷修饰），与捕获探针杂交并暴露生物素位点。
- 信号放大酶：Extravidin 标记碱性磷酸酶（Ex-Ap），经生物素–Extravidin 高亲和结合，催化底物水解。
- 底物/电活性产物：1-萘基磷酸酯（α-naphthyl phosphate）在 DEA 缓冲液（pH 9.6）中被 AP 转化为 α-萘酚（a-NAP），作为 DPV 氧化信号源。
- 反应介质：DEA 缓冲液（pH 9.6）含 1 mg/mL 1-萘基磷酸酯，维持酶反应并传导电子；DPV 在 +0.23 V vs Ag/AgCl 读取 a-NAP 氧化峰。
中文摘要
本研究报道了一种基于酶放大的电化学 microRNA（miRNA）检测方法，用于从细胞裂解液总 RNA 中检测乳腺癌相关 miRNA mir21。该方法将捕获探针或细胞裂解液通过 EDC/NHS 共价固定于铅笔石墨电极（PGE）表面，随后与 3' 端生物素标记的互补靶标杂交；Extravidin 标记的碱性磷酸酶（Ex-Ap）通过生物素–亲和素作用结合杂交产物，并将电不活性的 α-萘基磷酸酯底物催化转化为电活性 α-萘酚（a-NAP）。a-NAP 在 +0.23 V（vs Ag/AgCl）处被氧化，采用差分脉冲伏安法（DPV）读取信号。与传统鸟嘌呤氧化法相比，该酶促方法在细胞裂解液检测中信号更稳定、可区分含 mir21 与不含 mir21 样品；非互补序列实验证明其特异性，细胞裂解液检测限为 6 pmol。
英文摘要
In this work, a novel electrochemical microRNA (miRNA) detection method based on enzyme amplified biosensing of mir21 from cell lysate of total RNA was demonstrated. The proposed enzymatic detection method was detailed and compared with the conventional guanine oxidation based assay in terms of detection limit and specificity. For the detection of mir21, capture probes and/or cell lysates were covalently attached onto the pencil graphite electrode (PGE) by coupling agents of N-(dimethylamino)propyl-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysulfosuccinimide (NHS). Having immobilized the capture probe onto the surface of PGE, hybridization was achieved with a biotinylated (from its 3' end) complementary target. Extravidin labeled alkaline phosphatase (Ex-Ap) binds to the biotinylated target due to the interaction between biotin-avidin and the enzyme converts electro-inactive alpha naphtyl phosphate (the substrate) to electro-active alpha naphtol (α-NAP, the product). α-NAP was oxidized at +0.23 V vs Ag/AgCl and this signal was measured by Differential Pulse Voltammetry (DPV). The signals obtained from α-NAP oxidation were compared for the probe and hybrid DNA. The specificity of the designed biosensor was proved by using non-complementary sequences instead of complementary sequences and the detection limit of the assay was calculated to be 6 pmol for cell lysates.