组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
抗绿色荧光蛋白抗体（anti-GFP）、抗荧光素酶抗体（anti-luciferase）；样品基质：PBS/PBST缓冲液中的抗体溶液（微流控通道）
检测原理
该传感器采用生成-检测双元件SPRI微阵列。金表面先分别固定dsDNA模板和Cu(II)-NTA捕获层。引入无细胞IVTT体系后，T7 RNA聚合酶识别dsDNA上的T7启动子并转录mRNA，核糖体同步将mRNA翻译为His标签GFP或荧光素酶。蛋白扩散至相邻Cu(II)-NTA表面，通过His标签与Cu(II)配位定向捕获，形成蛋白质微阵列。随后加入抗体，抗体与对应蛋白特异性结合，使金膜表面质量/折射率增加，SPRI反射率Δ%R随之升高。双元件设计将合成区与检测区分离，减少RNA聚合酶、核糖体及蛋白非特异吸附干扰；IVTT从少量DNA模板放大蛋白产量，微流控小体积提高局部浓度，促进快速捕获。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
实验中，GFP检测元件在1800 s内SPRI反射率变化为16.4±0.5%，估计形成约10^12 molecules/cm^2的GFP单层；控制元件仅出现可忽略信号，表明非特异吸附低。抗体检测中，50 nM anti-GFP使GFP检测元件在800 s后Δ%R为1.4±0.2%，100 nM anti-luciferase使荧光素酶检测元件在1400 s后Δ%R为1.7±0.3%，且仅在对应元件出现信号，选择性良好。微阵列可在4 °C稳定保存最多3天，芯片经洗涤和重新充Cu(II)后可循环使用，作者建议可重复芯片使用Ni(II)。方法仅需10^-14–10^-15 mol dsDNA模板产生10^-11–10^-12 mol蛋白，局部浓度估计为10^-5–10^-6 M，无需离芯片纯化，适合多重SPRI临床和研究应用。
传感器的构成
- 基底/换能器：金薄膜微阵列（gold thin film microarray elements），作为SPRI光学换能表面并承载生成、检测与控制元件。
- 生成元件修饰层：11-巯基十一胺（MUAM）与聚-L-谷氨酸（pGlu）单层，经NHSS-EDC偶联固定dsDNA模板。
- 模板识别层：双链DNA（dsDNA）编码His标签GFP或荧光素酶，含T7启动子、核糖体结合位点、His标签和终止子，用于表面转录。
- 检测元件修饰层：MUAM/pGlu上连接氨基-NTA（amino-NTA），再暴露1 mM Cu(II)形成Cu(II)-NTA表面，用于His标签蛋白定向捕获。
- 控制元件修饰层：无金属NTA（metal-free NTA）单层，未暴露Cu(II)，用于非特异吸附对照。
- 识别元件：His标签GFP或His标签荧光素酶蛋白，由无细胞IVTT合成并吸附于Cu(II)-NTA表面，作为抗体识别配体。
- 合成反应体系：RTS 100 E. coli HY蛋白表达试剂盒，含T7 RNA聚合酶、rNTPs、tRNAs、氨基酸和核糖体，用于耦合转录翻译。
- 封闭/清洗层：3% BSA、PBST和1× PBS用于洗涤反应组分并封闭非特异位点。
- 信号标记物：无外加标记，抗GFP或抗荧光素酶抗体直接结合蛋白，SPRI反射率变化作为读出信号。
中文摘要
本文报道了一种在芯片上由双链DNA微阵列直接合成蛋白质微阵列并用于表面等离子共振成像（SPRI）抗体生物传感的方法。在微流控芯片中，编码His标签绿色荧光蛋白（GFP）或His标签荧光素酶的双链DNA元件作为生成元件，通过表面RNA聚合酶反应转录出多个mRNA拷贝；随后在无细胞蛋白合成体系中，mRNA被翻译为His标签蛋白。生成的蛋白扩散至相邻的Cu(II)-NTA检测元件并特异性吸附，从而在芯片上原位形成蛋白质微阵列。该双元件格式将蛋白合成与捕获分离，显著降低酶和蛋白非特异吸附带来的干扰。作者利用SPRI实时监测抗GFP和抗荧光素酶抗体的特异性吸附，验证了蛋白质微阵列的形成。该方法可在数小时内从DNA微阵列一步制备可用于多重SPRI检测的蛋白质微阵列，具有用于临床和研究应用的潜力。
英文摘要
Protein microarrays are fabricated from double-stranded DNA (dsDNA) microarrays by a one-step, multiplexed enzymatic synthesis in an on-chip microfluidic format and then employed for antibody biosensing measurements with surface plasmon resonance imaging (SPRI). A microarray of dsDNA elements (denoted as generator elements) that encode either a His-tagged green fluorescent protein (GFP) or a His-tagged luciferase protein is utilized to create multiple copies of mRNA (mRNA) in a surface RNA polymerase reaction; the mRNA transcripts are then translated into proteins by cell-free protein synthesis in a microfluidic format. The His-tagged proteins diffuse to adjacent Cu(II)-NTA microarray elements (denoted as detector elements) and are specifically adsorbed. The net result is the on-chip, cell-free synthesis of a protein microarray that can be used immediately for SPRI protein biosensing. The dual element format greatly reduces any interference from the nonspecific adsorption of enzyme or proteins. SPRI measurements for the detection of the antibodies anti-GFP and antiluciferase were used to verify the formation of the protein microarray. This convenient on-chip protein microarray fabrication method can be implemented for multiplexed SPRI biosensing measurements in both clinical and research applications.