A lateral flow biosensor for detection of single nucleotide polymorphism by circular strand displacement reaction.

侧流层析试纸条

单核苷酸多态性（SNP）靶DNA（K-ras癌基因第12密码子野生型/突变型序列）；样品基质：合成靶DNA、人临床血液基因组DNA（提取并变性）

野生型靶DNA与生物素发夹探针杂交后使其打开，地高辛报告探针同时退火至SNP位点两侧。T4 DNA连接酶仅当序列完全匹配时连接发夹探针5'-PO4与报告探针3'-OH；随后短引物退火，Klenow聚合酶在dNTPs存在下延伸并置换靶DNA，触发环状链置换反应，循环生成大量生物素-地高辛双标记DNA。产物与链霉亲和素-金纳米颗粒结合后上样，被检测线抗地高辛抗体捕获，金纳米颗粒聚集形成红色检测线。突变型靶DNA因单碱基错配不能被连接，不产生双标记产物，故无检测线。

LOD: 0.01 fM；线性范围: 1 fM–100 fM

该传感器对1 fM野生型靶DNA呈阳性，对10 mM单碱基突变靶DNA及10 mM三种随机序列DNA均无检测线，可区分单碱基错配。重复性方面，10、100和1000 fM样品各测20条试纸条，检测线强度CV分别为10.8%、9.54%和7.53%。临床验证中，3例人临床血液提取的野生型基因组DNA均出现检测线，无基因组DNA对照无检测线，结果与PCR一致。方法在室温2.5 h内完成，无需复杂仪器，可肉眼判读或用便携试纸条读数器半定量，适合床旁诊断。

本文报道了一种基于环状链置换反应（CSDPR）的侧流层析生物传感器，用于单核苷酸多态性（SNP）的可视化检测。该体系利用T4 DNA连接酶对SNP位点单碱基错配的高保真识别能力，结合CSDPR在恒温下对DNA产物的指数级信号放大，以及金纳米颗粒（AuNPs）的比色光学特性，将核酸信号转化为肉眼可见的红色条带。检测时，野生型靶DNA打开生物素标记发夹探针，并与地高辛标记报告探针退火；T4 DNA连接酶连接相邻探针后，短引物与Klenow聚合酶启动链置换扩增，生成大量生物素-地高辛双标记DNA。产物与链霉亲和素-金纳米颗粒结合后上样，被硝酸纤维素膜检测线上的抗地高辛抗体捕获，形成检测线；质控线捕获多余金标发夹。突变型靶DNA因连接酶不连接而不能产生产物，仅显示质控线。该传感器对合成野生型靶DNA的检出限达0.01 fM，并可用于人临床血液基因组DNA检测。