组成图示
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传感器类型
化学发光生物传感器
检测对象
前体白细胞介素-1β加工（pro-IL-1β processing）、caspase-1活性（caspase-1 activity）、NLRP3炎症小体活性（NLRP3 inflammasome activity）；样品基质：活细胞（HEK293、骨髓来源巨噬细胞BMDM、J774A.1巨噬细胞）
检测原理
R-proIL1b-V 由 RLuc8-pro-IL-1β-Venus 共价融合构成。加入 coelenterazine h 后，RLuc8 催化其氧化并产生 480 nm 生物发光；未受刺激时 pro-IL-1β 的 N 端与 C 端靠近，RLuc8 与 Venus 距离小于 100 Å，发生分子内 BRET，Venus 发射 535 nm 荧光。NLRP3/ASC 炎症小体被 nigericin 或 ATP 激活后，caspase-1 切割 pro-IL-1β 的 Asp27 和 Asp116 位点，使供体与受体分离，BRET 能量转移减弱。仪器同时采集 480 nm 与 535 nm 信号，以 535/480 比值（mBU）读出；比值随 caspase-1 活性和 pro-IL-1β 加工程度增加而下降，从而实时反映炎症小体活性。
检测灵敏度
EC50: 0.644 U recombinant human caspase-1
效应效果
传感器为比率型，BRET 不随表达量变化，未激活时稳定 40 min。HEK293 中 nigericin 刺激后约 5 min 下降，25 min 降低约 25%。BMDM 稳定 10 min 后下降，20 min 稳态；J774A.1 下降更快（<6 min），半衰期 3.88/3.34 min。ASC/NLRP3 缺失、D27A/D116A 突变、caspase-1 抑制剂和 glyburide 均阻断下降。单细胞 ATP 中，WT BMDM 10/20 min BRET 降低 35.2±6.0/49.2±7.2 mBU，P2X7 缺失无变化。相比 WB/ELISA，可实时单细胞及 96/384 孔筛选。
传感器的构成
- 供体报告层：RLuc8（Renilla luciferase 变体），催化 coelenterazine h 产生 480 nm 生物发光，作为 BRET 供体
- 识别底物层：pro-IL-1β（前体白细胞介素-1β），含 caspase-1 切割位点 Asp27/Asp116，被切割后改变供受体距离
- 受体报告层：Venus（黄色荧光蛋白变体），接受 RLuc8 能量后发射 535 nm 荧光，作为 BRET 受体
- 融合传感层：R-proIL1b-V 融合蛋白，将 RLuc8、pro-IL-1β 和 Venus 共价连接，形成分子内 BRET 对
- 化学发光底物：coelenterazine h（海肾荧光素），为 RLuc8 提供发光底物，触发供体发射
- 表达载体/细胞基质：pcDNA3.1+ 质粒转染 HEK293、BMDM、J774A.1 等活细胞，实现传感器表达与活细胞检测
中文摘要
炎症是机体对抗感染和损伤的重要保护机制，但免疫应答失控可导致慢性炎症及相关疾病。白细胞介素-1β（IL-1β）是启动炎症的关键细胞因子，其前体 pro-IL-1β 需经 caspase-1 切割生成成熟活性形式，而 caspase-1 的激活受 NLRP3 炎症小体调控。传统 Western blot 和 ELISA 等方法无法在活细胞中以高时空分辨率实时监测 IL-1β 加工。本研究构建了一种基于生物发光共振能量转移（BRET）的基因编码比率型生物传感器 R-proIL1b-V，将 RLuc8 荧光素酶变体与 pro-IL-1β 的 N 端融合、Venus 黄色荧光蛋白变体与 C 端融合。该传感器可在活巨噬细胞中以秒级时间分辨率和单细胞空间分辨率实时监测 pro-IL-1β 加工，并首次描述炎症小体活性动力学，证明 pro-IL-1β 加工发生在整个细胞质。
英文摘要
Inflammation is fundamental for protecting the organism against infection and injury. However, a failure to control immune response results in chronic inflammation and several associated disorders such as pain and loss of function. Initiation of inflammation is orchestrated by cytokines, among which IL-1β is particularly important. IL-1β is synthesized as an inactive protein that has to be processed by the inflammasome to generate the mature bioactive form. Conventional techniques cannot monitor IL-1β activation with high spatial and temporal resolution. In this study, we present a ratiometric biosensor that allows monitoring IL-1β processing in real time, with a temporal resolution of seconds and with a single-cell spatial resolution. Using this sensor, to our knowledge, we describe for the first time the kinetic of the inflammasome activity in living macrophages. With this new probe, we also demonstrated that the pro-IL-1β processing occurs all over the cytoplasm.