组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
登革病毒1型互补DNA（DENV1 cDNA，31-mer ssDNA）；样品基质：人血清来源DENV1 RNA经逆转录和非对称PCR扩增的cDNA PCR产物稀释液
检测原理
该传感器以铂丝为基底，先溅射铝膜并通过电化学阳极氧化形成纳米多孔氧化铝膜。APS处理引入氨基，戊二醛将5'-氨基DNA探针共价固定于孔道内壁。加入DENV1 cDNA后，探针与目标互补杂交形成双链DNA，占据并缩小纳米孔道有效尺寸，同时双链DNA负电荷增加，阻碍Fe(CN)6^4-向电极表面传质。差分脉冲伏安法（DPV）记录Fe(CN)6^4-氧化峰电流，目标浓度越高，氧化峰电流越低，信号与目标浓度对数呈线性关系。该机制无需荧光或酶标记放大，主要依靠纳米孔道内质量传递变化实现检测。
检测灵敏度
LOD: 9.55×10^-12 M；线性范围: 10^-12–10^-6 M（6个数量级）；R^2 = 0.98
效应效果
传感器对DENV1 cDNA在10^-12–10^-6 M线性良好（R^2=0.98），LOD为9.55×10^-12 M，较比色、光学和荧光DNA传感器提高5–6个数量级。三个独立传感器对10^-6 M目标的归一化DPV电流标准偏差为3.4%，分析时间约45 min。53°C孵育30 min可区分DENV1完全互补序列与DENV3单碱基错配序列，显示单碱基特异性。传感器可在75°C、0.5 M Tris（pH 7.0）中再生2–3次，结合/未结合信号比保持4.9–5.4，第三次后氧化铝结构可能脱落。对人血清来源DENV1 RNA经非对称PCR扩增的183 bp cDNA样品（10^-11–10^-8 M）检测有效，未报告加标回收率，作者认为可用于登革病毒监测。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：铂丝电极（Pt wire，封装于环氧微移液器尖端，作为工作电极）
- 金属前驱层：溅射铝膜（Al，99.999%，用于后续阳极氧化）
- 纳米多孔膜：氧化铝纳米多孔膜（nanoporous alumina, Al2O3，电化学阳极氧化形成，孔径约10–150 nm）
- 硅烷化修饰层：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS，5%溶液处理，引入氨基）
- 交联固定层：戊二醛（glutaraldehyde，12 h处理，共价连接5'-氨基DNA探针）
- 识别元件：5'-氨基化DNA探针（5'-NH2 DNA probe，DENV1 31-mer序列，固定于孔道内）
- 封闭/中和层：丙胺（propylamine，10^-6 M，中和过量戊二醛并促进杂交）
- 信号介质：六氰合铁(II)酸钾/Fe(CN)6^4-（1 mM，PBS中氧化还原探针，用于DPV电流读出）
中文摘要
本文报道了一种基于纳米多孔氧化铝膜的超灵敏DNA生物传感器，用于检测登革病毒1型（DENV1）RNA逆转录得到的互补DNA（cDNA）。作者通过电化学阳极氧化在铂丝电极表面制备氧化铝纳米多孔膜，利用5'-氨基化DNA探针经3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS）和戊二醛共价固定于孔道内壁。当目标DENV1 cDNA与孔内探针杂交时，双链DNA占据纳米孔道，改变孔径和离子/氧化还原物质传质，使六氰合铁(II)酸钾（Fe(CN)6^4-）的差分脉冲伏安法（DPV）氧化峰电流下降。该传感器对31-mer单链DNA具有跨越6个数量级的线性响应，检测限为9.55×10^-12 M。研究进一步用来自人血清DENV1 RNA的非对称PCR cDNA样品验证其适用性，并显示对DENV3单碱基错配序列具有良好特异性。
英文摘要
A nanoporous alumina membrane-based ultrasensitive DNA biosensor is constructed using 5'-aminated DNA probes immobilized onto the alumina channel walls. Alumina nanoporous membrane-like structure is carved over platinum wire electrode of 76 µm diameter dimension by electrochemical anodization. The hybridization of complementary target DNA with probe DNA molecules attached inside the pores influences the pore size and ionic conductivity. The biosensor demonstrates linear range over 6 order of magnitude with ultrasensitive detection limit of 9.55×10(-12) M for the quantification of ss-31 mer DNA sequence. Its applicability is challenged against real time cDNA PCR sample of dengue virus serotype1 derived from asymmetric PCR. Excellent specificity down to one nucleotide mismatch in target DNA sample of DENV3 is also demonstrated.