组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
军团菌单链靶DNA（Legionella sp. ssDNA，21-mer）及军团菌肺炎基因组DNA扩增产物（L. pneumophila genomic DNA PCR amplicon）；样品基质为TRIS缓冲液中的单链DNA溶液及非对称PCR产物稀释液
检测原理
传感器以铂丝电极为工作电极，氧化铝纳米多孔膜覆盖其表面，5'-氨基DNA探针经APS和戊二醛共价固定于纳米通道内。当军团菌互补靶DNA进入孔道并与探针杂交时，形成的双链DNA占据孔道空间，增加孔道内摩擦与空间位阻，限制Fe(CN)6^4-从溶液向铂电极的扩散。差分脉冲伏安法（DPV）测量Fe(CN)6^4-的氧化峰电流，杂交程度越高，氧化峰电流越低；电化学阻抗谱（EIS）中电荷转移电阻相应增大。该过程无需荧光或酶标记，信号直接来源于氧化还原探针的法拉第电流变化，并通过温控杂交实现序列选择性。
检测灵敏度
LOD: 3.1 × 10^-13 M；线性范围: 10^-13–10^-6 M；R^2 = 0.98
效应效果
该传感器在45 ℃和57/58 ℃温控杂交条件下，可区分互补序列与单碱基错配（MM1，Tm 44 ℃）及三碱基错配（MM3，Tm 57 ℃）序列，错配靶标不引起显著DPV电流变化。分析时间约45 min，信号误差约5.3%，但因对数浓度依赖，浓度估计误差约一个数量级。传感器经75 ℃、0.5 M Tris（pH 7.0）处理30 min后可再生，重复性良好。对非对称PCR获得的157 bp军团菌基因组DNA扩增产物（10^-12、10^-11、10^-10 M）呈连续响应，表明可用于环境病原监测。作者认为其灵敏度优于现有无标记DNA传感器，并与酶放大、电化学放大及阻抗型DNA传感器相当。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：铂丝电极（Pt wire，直径约76 μm），作为工作电极并支撑氧化铝膜
- 封装结构：环氧树脂（epoxy resin）与微移液器尖，固定铂丝并构成单丝电极
- 阳极氧化前驱层：铝膜（Al film），溅射于铂丝表面并经阳极氧化形成氧化铝纳米孔
- 纳米多孔膜：氧化铝纳米多孔膜（nanoporous alumina membrane, Al2O3），提供高比表面纳米通道并限域固定DNA探针
- 表面活化层：3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APS），在氧化铝表面引入氨基用于戊二醛偶联
- 交联固定层：戊二醛（glutaraldehyde, GA），连接APS与5'-氨基DNA探针实现共价固定
- 识别元件：5'-氨基化32-mer DNA探针（5'-NH2 DNA probe），固定于纳米通道内并与军团菌靶DNA互补杂交
- 封闭/淬灭层：丙胺（propylamine），中和过量戊二醛并降低非特异结合
- 信号指示剂：六氰合铁(II/III)酸钾（K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6，Fe(CN)6^4-/3-），作为无标记电化学氧化还原探针
中文摘要
本文报道了一种基于电化学纳米多孔氧化铝膜的无标记DNA生物传感器，用于军团菌（Legionella sp.）核酸检测。通过电化学阳极氧化在直径约76 μm的铂丝电极上制备氧化铝纳米多孔膜，将5'-氨基化32-mer DNA探针共价固定于纳米通道内。当互补靶DNA与探针杂交时，双链DNA占据并阻塞纳米孔，改变孔道内离子导电性及氧化还原探针Fe(CN)6^4-向铂电极的扩散。差分脉冲伏安法（DPV）监测Fe(CN)6^4-氧化峰电流，电流随靶DNA浓度增加而下降。该传感器对21-mer单链DNA具有7个数量级宽线性范围，检出限为3.1×10^-13 M，并能区分单碱基错配（MM1）和三碱基错配（MM3）序列。作者还利用非对称PCR获得的军团菌肺炎基因组DNA样本验证了其实际应用潜力。
英文摘要
An electrochemical nanoporous alumina membrane-based label free DNA biosensor is developed using 5'-aminated DNA probes immobilized into the nanochannels of alumina. Alumina nanoporous membrane-like structure is carved over platinum wire electrode of 76 μm diameter dimension by electrochemical anodization. The hybridization of complementary target DNA with probe DNA molecules attached inside the nanochannels influences the pore size and ionic conductivity. Electrochemical biosensing signal is derived from only redox species Fe(CN)(6)(4-) across single wire Pt electrode. The biosensors sensing mechanism relies on the monitoring of electrode's Faradaic current response toward redox species, Fe(CN)(6)(4-), which is sensitive toward the hybridization of complementary target with probe DNA immobilized into the alumina nanochannels. The biosensor demonstrates wide linear range over 7 orders of magnitude with ultrasensitive detection limit 3.1×10(-13) M for the quantification of ss 21 mer DNA sequence and selectively differentiates the complementary sequence from target sequences with single base mismatch (MM1) and triple bases mismatch (MM3) of different strain of Legionella sp. Its applicability is also challenged against real time Legionella pneumophila genomic DNA sample derived from the asymmetric PCR method.