组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
雄甾酮（androsterone，3α-hydroxy-5α-androstan-17-one）；样品基质：人血清（加标）
检测原理
该传感器以3a-HSD为识别元件，固定于MWCNTs/OPPF6/NAD+复合电极表面。当样品中的雄甾酮进入电极界面时，3a-HSD特异性催化其3α-羟基氧化为4-雄烯二酮，同时掺入复合层的NAD+被还原为NADH。NADH在+400 mV下于复合电极发生电化学氧化，产生与NADH浓度成正比的稳态安培电流。MWCNTs提供高导电性和快速电子转移，OPPF6离子液体降低背景电流并增强抗污稳定性，NAD+局部富集提高辅因子利用效率。因此，安培电流随雄甾酮浓度增加而增大，实现酶催化与电化学换能耦合的检测。
检测灵敏度
LOD: 0.15 μM；线性范围: 0.5–10 μM；斜率: 70.3 μA/μM；R = 0.998；KappM: 36.0 μM
效应效果
传感器选择性较好：皮质醇、19-去甲睾酮在10倍生理浓度和睾酮在1000倍生理浓度下无明显干扰；β-雌二醇在干扰物/雄甾酮比0.05时相对误差>5%。尿酸和抗坏血酸在1.0×10^-5至1.0×10^-6 M时相对误差分别为3.8%和3.7%，可用Nafion膜降低但牺牲灵敏度。同一传感器对6.0 μM雄甾酮RSD 1.8%，5个不同传感器RSD 3.5%；至少6天斜率无显著变化。人血清加标1.25 μM，标准加入法回收率97.2%–103%，RSD 2.7%。斜率比玻璃碳电极3a-HSD/戊二醛体系高200倍以上，KappM 36.0 μM低于189 μM，接近溶液酶30±3 μM，适用于血清快速分析。
传感器的构成
- 电极支架与导电接触：特氟龙支架（Teflon holder）和不锈钢螺钉，提供机械支撑与电接触
- 复合修饰层：多壁碳纳米管（MWCNTs）与辛基吡啶六氟磷酸盐离子液体（OPPF6）按30:70混合，形成导电复合糊，促进电子转移并降低背景电流
- 辅因子层：氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）以约20%质量分数掺入复合糊，作为3a-HSD反应辅因子，局部富集并减少泄漏
- 识别元件：3α-羟基甾体脱氢酶（3a-HSD）滴加于电极表面干燥固定，催化雄甾酮3α-羟基氧化
- 信号产物：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）由酶反应生成，在+400 mV被氧化产生安培电流
- 检测介质：0.1 M TRIS缓冲液（pH 8.5），维持酶活性与电化学环境
- 样品基质：人血清（加标雄甾酮），稀释后用于标准加入法测定
中文摘要
本文报道了一种用于测定雄甾酮的3α-羟基甾体生物传感器。将3α-羟基甾体脱氢酶（3a-HSD）固定于由多壁碳纳米管（MWCNTs）、辛基吡啶六氟磷酸盐离子液体（OPPF6）和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）组成的复合电极平台上。该构型可快速、灵敏且稳定地电化学检测酶反应生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。作者优化了传感器制备与性能相关的全部实验变量。在搅拌溶液、+400 mV安培检测条件下，雄甾酮在0.5–10 μM浓度范围内呈线性校准，斜率比此前报道高200倍以上；检出限为0.15 μM，表观米氏常数KappM为36.0 μM，与溶液中酶报道值相近。该3a-HSD/MWCNTs/OPPF6/NAD+生物传感器在加标人血清样品中测定雄甾酮获得良好结果。
英文摘要
A 3α-hydrosteroid biosensor for androsterone determination has been prepared by immobilizing the enzyme 3α-hydroxysteroid dehydrogenase (3α-HSD) in a composite electrode platform constituted of a mixture of multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs), octylpyridinium hexafluorophosphate (OPPF(6)) ionic liquid and NAD(+) cofactor. This configuration allowed the fast, sensitive and stable electrochemical detection of the NADH generated in the enzyme reaction. All the experimental variables involved in the preparation and performance of the enzyme biosensor were optimized. Amperometry in stirred solutions at +400 mV provided a linear calibration plot for androsterone in the 0.5-10 μM concentration range with a slope value more than 200-times higher than that previously reported. The detection limit achieved was 0.15 μM and a low value of the apparent Michaelis-Menten constant (K(app)(M)), 36.0 μM, similar to that reported for the enzyme in solution, was calculated. The 3α-HSD/MWCNTs/OPPF(6)/NAD(+) biosensor provided good results in the determination of androsterone in spiked human serum samples.