组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
单链DNA（ssDNA，如 dT70），样品基质为 Tris-KCl 缓冲液；双链DNA底物（dsDNA，含 oriD 的质粒），样品基质为 PcrA/RepD 解旋酶反应缓冲液。
检测原理
DCC-SSB 由 SSB G26C 四聚体与 IDCC/DCC 荧光团共价偶联构成。SSB 对 ssDNA 具有高亲和力和特异性，结合后改变二乙氨基香豆素微环境，使香豆素环与二乙氨基更易形成共平面体系，量子产率升高，荧光增强约5倍。ssDNA 浓度增加时，DCC-SSB 逐渐饱和，荧光信号线性上升后达到平台。用于解旋酶检测时，PcrA/RepD 水解 ATP 解开 dsDNA，实时产生 ssDNA；DCC-SSB 结合新生 ssDNA 引起荧光上升，停流荧光仪在 436 nm 激发、455 nm 截止滤片下读出，从而获得解旋速率。单分子 TIRFM 变体使用 Cy3B-SSB，表面固定复合物在倏逝波激发下，ssDNA 释放后招募 Cy3B-SSB 形成增强荧光斑点。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该探针具有特异性 ssDNA 结合，Kd 约 3 nM，结合速率 322 mM–1 s–1；标记使亲和力下降约30倍，但仍可定量。DCC-SSB 结合 ssDNA 荧光增强约5倍，激发/发射谱基本不变，适合停流快速动力学。在 PcrA/RepD 解旋体系中，200 nM DCC-SSB 可实时监测不同长度 oriD 质粒解旋，信号随 ssDNA 产生上升，全解旋时出现拐点用于校准。TIRFM 中 Cy3B-SSB 可单分子观察 AddAB、RecBCD、PcrA 解旋，平均速率与溶液 DCC-SSB 一致。未报告 RSD、回收率或临床样品验证。
传感器的构成
- 识别元件：大肠杆菌单链DNA结合蛋白 SSB（G26C 突变，四聚体），特异性结合 ssDNA，每个四聚体结合约65–70 nt。
- 信号标记物：N-[2-(碘乙酰胺基)乙基]-7-二乙氨基香豆素-3-酰胺 IDCC/DCC，共价连接至 SSB Cys26，结合 ssDNA 后荧光增强约5倍。
- 封闭剂：MESNA（2-巯基乙磺酸钠），用于封闭未反应 IDCC，避免非特异性标记。
- 检测介质：Tris-HCl/KCl 缓冲液（如 50 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM KCl、1 mM EDTA、10 mM MgCl2、10% ethanediol），维持蛋白与解旋酶活性。
- 读出装置：停流荧光仪（436 nm 激发、455 nm 截止滤片）或 TIRFM（Cy3B-SSB 单分子成像）。
中文摘要
解旋酶是一类重要的能量转换酶，通常将 ATP 水解与碱基配对核酸链的分离相偶联。研究其生化机制需要能够以不同方式监测反应进程的检测方法。本文以大肠杆菌单链 DNA 结合蛋白（SSB）为蛋白框架，构建一种用于单链 DNA（ssDNA）的无试剂荧光生物传感器。SSB 可快速、高亲和且特异性地结合 ssDNA；在该蛋白上连接荧光团后，结合事件可转化为荧光信号。作者选择 G26C 突变 SSB，并用二乙氨基香豆素（IDCC/DCC）标记，得到 DCC-SSB 探针。该探针结合 ssDNA 后荧光增强约 5 倍，且激发与发射光谱基本不变，因此可用于实时监测解旋酶沿双链 DNA 解旋产生 ssDNA 的进程。文中给出了 DCC-SSB 制备、表征及解旋酶动力学检测方案，并介绍了可用于单分子尺度观察解旋的变体。
英文摘要
Helicases are an important and much studied group of enzymes that generally couple ATP hydrolysis to the separation of strands of base-paired nucleic acids. Studying their biochemistry at different levels of organization requires assays that measure the progress of the reaction in different ways. One such method makes use of the single-stranded DNA-binding protein (SSB) from Escherichia coli. This is used as a protein framework to produce a "reagentless biosensor," making use of its tight and specific binding of single-stranded DNA. The attachment of a fluorophore to this protein produces a signal in response to that binding. Thus the (G26C)SSB, labeled with a diethylaminocoumarin, gives a ~5-fold fluorescence increase on binding to single-stranded DNA and this can be used to assay the progress of helicase action along double-stranded DNA. A protocol for this is described along with a variant that can be used to follow the unwinding on a single molecule scale.