组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
PFV-1 IN（Primate Foamy Virus Integrase）；样品基质为Hepes缓冲液（20 mM Hepes pH 8、10 mM MgCl2、100 mM NaCl）
检测原理
该传感器采用SPRi无标记检测。SF10棱镜上的50 nm金膜在830 nm光激发下产生表面等离子体共振，界面质量或折射率变化会改变反射率。金表面先短孵育EG4-OH形成稀疏抗污SAM，抑制PFV-1 IN对金表面的非特异吸附；随后SH-5T-dsDNA通过硫醇化学吸附固定，T5间隔臂使DNA远离金面、提高密度并减少变性。PFV-1 IN流过表面后与dsDNA特异性结合，结合蛋白质量增加使局部折射率升高，SPRi的CCD实时记录各斑点反射率随时间变化。结合相与解离相曲线经单指数或双指数拟合，得到ka、kd和KD；蛋白浓度升高时信号增强，并出现多相结合/寡聚化，低浓度下可分辨高亲和结合模式。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
30 s EG4-OH预处理后非特异吸附极低：非巯基dsDNA密度约5.5×10^9 molecules/cm2，仅占SH-dsDNA的0.17%和SH-5T-dsDNA的0.03%；裸金约4%。T5间隔臂使SH-5T-dsDNA密度达1.85×10^13 molecules/cm2，较无间隔臂3.37×10^12提高约5.5倍，并将dsDNA变性从裸金约40%降至5%。SPRi背景弱且瞬态，PFV-1 IN/dsDNA复合物可被0.1% SDS完全再生，10 h无劣化。200 nM时双相KD1=2.6×10^-8 M、KD2=9.1×10^-9 M；4 nM时单相KD=4.9×10^-10 M。作者认为该表面可避免背景扣除误差，适用于高非特异核酸蛋白复合物定量动力学研究。
传感器的构成
- 基底/换能器：玻璃棱镜SF10（n=1.707987@830 nm），经RIE活化，作为SPRi光路基底。
- 换能金属层：50 nm金膜（Au），热蒸发于SF10上，产生表面等离子体共振。
- 抗污修饰层：0.1 mM EG4-OH（羟基端四乙二醇十一烷硫醇）乙醇溶液自组装30 s，形成稀疏抗污SAM，抑制蛋白非特异吸附。
- 识别/靶标固定层：巯基双链DNA SH-5T-dsDNA（含mercapto-hexane和T5间隔臂），通过硫醇化学吸附固定，T5提高密度并减少变性。
- 被测物：PFV-1 IN（Primate Foamy Virus Integrase），以200 nM或4 nM缓冲液流过表面。
- 信号标记物：无外源标记，SPRi直接监测金膜界面折射率/反射率变化。
- 再生清洗：0.1% SDS缓冲液，用于解离PFV-1 IN/DNA复合物并恢复表面。
中文摘要
非特异性吸附是表面等离子共振（SPR）生物传感器定量分析的主要障碍，尤其影响蛋白与固定靶标相互作用的动力学测定。本文研究金表面四乙二醇自组装单分子层（EG4-OH SAM）的形成动力学，通过控制30秒短孵育形成缺陷较多但抗污的界面，再固定含五胸腺嘧啶间隔臂的巯基双链DNA（SH-5T-dsDNA），显著降低DNA变性（由裸金约40%降至5%）和非特异性吸附，提高DNA密度与可及性。利用SPRi实时监测猴泡沫病毒整合酶PFV-1 IN与随机序列dsDNA的结合，获得低纳摩尔级表观解离常数（KD1=2.6×10^-8 M，KD2=9.1×10^-9 M；低浓度下约4.9×10^-10 M），证明该抗污表面可消除背景扣除误差，适用于难测核酸蛋白复合物的定量动力学分析。
英文摘要
Non-specific binding to biosensor surfaces is a major obstacle to quantitative analysis of selective retention of analytes at immobilized target molecules. Although a range of chemical antifouling monolayers has been developed to address this problem, many macromolecular interactions still remain refractive to analysis due to the prevalent high degree of non-specific binding. In this manuscript we explore the dynamic process of the formation of self-assembled monolayers and optimize physical and chemical properties thus reducing considerably non-specific binding while maintaining the integrity of the immobilized biomolecules. As a result, analysis of specific binding of analytes to immobilized target molecules is significantly facilitated.