组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
胞质ATP（adenosine 5′-triphosphate, ATP）；样品基质：U87/U87vIII胶质母细胞瘤细胞胞质（活细胞）
检测原理
该传感器为基因编码型EAF荧光探针，由改造的枯草芽孢杆菌F0F1 ATP合酶ε亚基ATP结合模拟物分别与GFP和YFP融合构成。ε亚基模拟物可结合ATP而不水解；ATP结合后引起探针构象变化，改变GFP与YFP之间的相互作用，使在488 nm激发下YFP受体发射（约520 nm）增强，即增强受体荧光（EAF）。不同于传统FRET，GFP与YFP可在相近激发波长下工作。由于EAF强度随胞质ATP浓度升高而增强，因此可通过共聚焦显微镜或光谱荧光分析实时、单细胞地监测ATP通量。该机制不依赖酶促放大，主要依靠ATP结合诱导的构象变化与荧光增强实现信号转换。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该EAF传感器在活U87和U87vIII胶质母细胞瘤细胞中特异性报告胞质ATP，U87vIII的EAF信号高于U87。ENTPD5敲低12 h后，单细胞EAF信号升高，提示胞质ATP增加，并与荧光素酶法测得的全细胞ATP升高一致。传感器可实时监测ATP通量，且作者指出可改造用于线粒体、核和内质网ATP监测。临床组织分析显示超过68%的GBM核心ENTPD5高表达，高表达患者生存显著降低（p<0.034），说明该传感器可作为GBM代谢监测工具，并支持ENTPD5作为治疗靶点。
传感器的构成
- 细胞定位基质：U87/U87vIII胶质母细胞瘤细胞胞质，作为传感器表达与ATP监测的活细胞环境
- 表达载体：pAcGFP1-C哺乳动物表达载体（人源化密码子），用于在GBM细胞中表达EAF传感器
- 识别元件：Bacillus subtilis F0F1 ATP合酶ε亚基改造模拟物，特异性结合ATP而不水解
- 荧光供体：GFP，连接于ε亚基模拟物C端，作为EAF供体
- 荧光受体：YFP，连接于ε亚基模拟物N端，作为EAF受体，ATP结合后发射增强
- 突变修饰层：Val9、Leu42、Phe67、Leu78等疏水残基替换为亲水残基，降低非特异疏水相互作用
中文摘要
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是人类最侵袭性的脑肿瘤，现有治疗反应差，生存率极低。内质网UDPase——胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶5（ENTPD5）最近被鉴定为Akt/磷脂酰肌醇3-激酶/磷酸酶与张力蛋白同源物（PI3K/PTEN）调控环路的关键组分，可在体外协同有氧糖酵解与癌细胞增殖。本研究利用新型增强受体荧光（EAF）单细胞ATP生物传感器，分析ENTPD5介导的胞质ATP调节。结果显示，ENTPD5依赖性细胞ATP调节改变GBM体外代谢动力学，提高有氧糖酵解和脂肪酸氧化的分解代谢效率。此外，ENTPD5在GBM小鼠异种移植瘤和患者肿瘤中均上调，并与患者生存显著降低相关。这些结果不仅提供了监测ATP通量和细胞代谢动力学的新工具，也鉴定出GBM的新型治疗靶点。
英文摘要
Gliomablastoma multiforme (GBM) is the most aggressive of brain cancers in humans. Response to current therapies remains extremely poor, with dismal survival statistics. Recently, the endoplasmic reticulum UDPase, ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 5 (ENTPD5), was identified as a key component in the Akt/phosphatidylinositol 3-kinase/phosphatase and tensin homolog regulatory loop, capable of synergizing aerobic glycolysis and cancer cell proliferation in vitro. Utilizing a novel enhanced acceptor fluorescence-based single-cell adenosine 5'-triphosphate (ATP) biosensor, we analyzed ENTPD5-mediated modulation of cytosolic ATP. Here, ENTPD5-dependent modulation of cellular ATP in GBM results in altered metabolic kinetics in vitro, increasing the catabolic efficiencies of aerobic glycolysis and fatty acid oxidation. Additionally, an upregulation of ENTPD5 in both GBM mouse xenografts and in GBM patient tumors was identified, resulting in dramatically reduced survival. Therefore, these results not only provide new tools to monitor ATP flux and cellular metabolism kinetics but also identified a novel therapeutic target for GBM.