组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
靶标DNA A2（单链寡核苷酸，ssDNA）；样品基质为杂交缓冲液（20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、10 mM MgCl2，pH 7.4）
检测原理
传感器以金电极为基底，捕获探针A1-SH通过Au-S键自组装于表面，MCH封闭非特异性位点。加入靶标DNA A2后，A2与A1杂交；连接探针A3与A2的另一端杂交，同时A3的另一端又能与新的A2杂交，从而在电极表面形成由多个A2和A3组成的超级三明治长串联体。该结构使电极表面负电荷密度和膜厚度增加，阻碍外部氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-接近电极并发生电子转移，电荷转移电阻Rct增大。EIS通过Nyquist图监测Rct变化，ΔRct随A2浓度升高而线性增加，实现无标记定量检测。
检测灵敏度
LOD: 1.7 nM；线性范围: 5 nM–1 mM；灵敏度斜率: 0.0920；线性方程: ΔRct = 0.0920C_A2 + 2.9027；R = 0.9968
效应效果
在相同1 mM A2和A3条件下，超级三明治体系的ΔRct超过传统三明治体系的3倍，说明信号放大明显。杂交条件优化显示500 mM NaCl时ΔRct最大，4 h杂交后信号趋于稳定。凝胶电泳证实超级三明治结构形成两条梯带，最大长度约200–250 bp，而传统三明治结构因片段小于50 bp未观察到明显条带。选择性方面，400 nM的单碱基、三碱基和五碱基错配靶标均能被明显区分。方法无需氧化还原标记，EIS在小电位窗口进行，对生物相互作用破坏较小，作者认为其简单、低成本，可拓展至其他DNA体系检测更广泛分析物。
传感器的构成
- 基底/换能器电极：金电极（Au electrode，2.0 mm），经氧化铝抛光和电化学清洗，作为工作电极。
- 识别元件：捕获探针A1（5'-CCT ACC CAC ATT CTG AGA ATA CCA ACC CG-SH-3'），经TCEP还原后通过Au-S键自组装于金表面，捕获靶标DNA。
- 封闭剂：6-巯基-1-己醇（MCH），填充非特异性吸附位点，降低背景阻抗。
- 识别/放大元件：连接探针A3（5'-CCT ACC CAC ATT CTG AGA ATA CCA ACC CG-3'），与靶标A2另一端杂交并继续与A2杂交，形成超级三明治串联体。
- 信号标记物：外部氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-（K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]，10 mM，0.1 M PBS），用于EIS电子转移监测。
- 读出系统：电化学工作站CHI 660D，三电极体系，EIS Nyquist图监测Rct/ΔRct。
中文摘要
本文报道了一种基于超级三明治（super-sandwich）策略的无标记DNA电化学生物传感器，采用电化学阻抗谱（EIS）进行信号读出。传统三明治法中每个捕获探针通常只能结合一个靶标和一个信号探针，信号放大有限；为此作者设计了信号增强构型，使连接探针A3能够与靶标DNA A2的两个区域杂交，并在电极表面形成由多个靶标和连接探针组成的长串联体。该结构显著增加电极表面负电荷和膜厚度，阻碍外部氧化还原探针[Fe(CN)6]3-/4-的电子转移，使电荷转移电阻Rct增大。通过监测ΔRct可实现对靶标DNA的无标记检测，检出限为1.7 nM。凝胶电泳结果进一步证实了超级三明治结构的形成。
英文摘要
The focus of this work was on designing a label-free DNA biosensor based on a super-sandwich assay using the electrochemical impedance spectroscopy technique. For this purpose, we designed a signal-up configuration whose linker probes could hybridize with two regions of the target DNA. In this configuration, the presented target DNA would effectively decrease the electron transfer, which would improve the sensitivity of the sensor. Ultimately, we employed gel electrophoresis to further confirm the formation of the proposed super-sandwich structure.