Picomolar level profiling of the methylation status of the p53 tumor suppressor gene by a label-free electrochemical biosensor.

电化学生物传感器

p53基因甲基化状态（p53 gene methylation status，含全甲基化p53基因）；样品基质：合成p53 DNA序列（不同甲基化状态），预期肿瘤细胞来源DNA

先亚硫酸氢盐处理p53基因，未甲基化C脱氨为U，甲基化mC保留，甲基化信息转为碱基序列差异。修饰在电极上的中性PNA探针与完全甲基化p53互补杂交，未甲基化/部分甲基化因错配杂交效率低。杂交后DNA骨架带负电磷酸基，溶液中[Ru(NH3)6]3+静电吸附到双链骨架，形成电活性复合物。CV/DPV中[Ru(NH3)6]3+发生还原，峰电流随杂交程度和全甲基化p53浓度增加而增大。PNA无磷酸负电，未杂交时不结合指示剂，降低背景；Au NPs扩大表面积并促进电子转移，实现无标记超灵敏检测。

LOD: 18 pM；线性范围: 50 pM–96 nM；灵敏度斜率: 4.9（Ipc (mA) = 4.9 logc (pM) - 6.7）；R = 0.9988

该传感器可区分全甲基化、单甲基化和未甲基化p53序列，CV/DPV峰电流随甲基化程度增加而增大；未甲基化p53仅引起微弱电流增加，全甲基化p53产生显著还原峰。对序列中部甲基化比顶部甲基化响应更高，体现对甲基化位点的分辨能力。全甲基化p53定量LOD为18 pM，比先前电化学方法低约三个数量级。方法无需标记，可分析多个CpG位点，适用于任意DNA序列甲基化分析。文中未报告RSD、稳定性、实际样品回收率，但作者提出将用于肿瘤细胞来源p53真实样品分析。

DNA甲基化与基因表达调控和癌症发生密切相关，p53肿瘤抑制基因启动子CpG岛异常甲基化是癌症表观遗传标志。传统甲基化检测方法操作复杂、仪器昂贵或需放射性标记。本文报道一种无标记电化学生物传感器，结合亚硫酸氢盐转化，实现p53基因甲基化状态的超灵敏分析。传感器以玻碳电极为基底，胆碱自组装单层和金纳米颗粒修饰，固定中性肽核酸（PNA）捕获探针，并以六氨合钌（[Ru(NH3)6]3+）为电活性指示剂。亚硫酸氢盐将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，甲基化胞嘧啶保留；完全甲基化p53与PNA互补杂交后，[Ru(NH3)6]3+静电结合DNA骨架，循环伏安和差分脉冲伏安还原电流随甲基化程度和浓度增大。该方法可区分不同CpG位点和甲基化状态，全甲基化p53检出限为18 pM，比先前方法低约三个数量级，有望用于肿瘤细胞p53甲基化分析。