组成图示
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传感器类型
电化学生物传感器
检测对象
结核分枝杆菌靶DNA序列（Mycobacterium tuberculosis target DNA, T）；样品基质：杂交缓冲液（10 mM PBS，1.0 M NaCl）/合成DNA溶液
检测原理
传感器以金电极为换能器，捕获探针C通过巯基自组装固定，MCH封闭表面。靶DNA T先于90°C变性打开发夹-茎环结构，再在50°C与生物素标记报告探针S杂交，形成dsDNA(T1-S)-ssDNA(T2)；随后在45°C与电极上捕获探针C杂交，形成完整三明治双链。S末端的生物素与链霉亲和素-HRP特异性结合，HRP催化TMB在H2O2存在下氧化，产生可被电化学工作站采集的安培电流。靶浓度越高，表面形成的三明治结构和HRP越多，电流越大。多步温度控制通过分步匹配不同区段熔解温度，提高杂交效率和特异性，酶催化TMB提供信号放大。
检测灵敏度
LOD: 2.6 × 10-13 M；线性范围: 10 pM–250 pM；斜率: 0.85（拟合式 I(nA) = 376.3282 + 0.8575CDNA(pM)）；r = 0.9991
效应效果
在10 nM靶序列下，完全匹配序列电流约为两种单碱基错配序列的两倍，非互补序列电流与空白相当，选择性优于传统一步杂交法。计时库仑法显示多步法表面DNA密度为3.7×10^12 mol/cm2（ΔQ=0.72 μC），一步法为2.0×10^12 mol/cm2（ΔQ=0.40 μC），几乎两倍。传感器在10 pM–250 pM线性，r=0.9991，LOD为2.6×10^-13 M。5个电极检测10 nM靶序列RSD为7.43%。经90°C 5 min热变性再生，5次循环后仍保持显著性能。作者认为该传感器适合检测易形成内部杂交的病原DNA，如结核分枝杆菌，具有临床应用潜力。
传感器的构成
- 工作电极：金电极（AuE，Φ=2 mm），经氧化铝抛光和循环伏安清洗，作为电化学换能器。
- 捕获探针层：5′-SH-C6-TTTTTTTTTTAACACGTTCCACAACTTCCACACCTT（C），巯基末端自组装于AuE，与靶序列T2区互补。
- 封闭修饰层：巯基己醇（MCH，2 mM），封闭金表面非特异性吸附位点，形成ssDNA/MCH/AuE。
- 报告探针：5′-CTTGAGGAGAACTTATGGGAGAAACGG-biotin（S），生物素标记，与靶序列T1区互补，形成dsDNA(T1-S)-ssDNA(T2)。
- 封闭剂：牛血清白蛋白（BSA，1 mg/mL），封闭残余非特异性吸附位点。
- 信号标记物：链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP，0.5 U/mL），结合生物素并催化TMB氧化。
- 底物/电子供体：3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）与H2O2，在HRP催化下产生电化学电流。
中文摘要
本文报道了一种基于多步温度控制杂交策略的三明治型电化学DNA生物传感器，用于高灵敏、高选择性地检测具有发夹-茎环二级结构的靶序列。传统一步杂交法对易形成分子内二级结构的靶序列效率较低。作者提出先于90°C热变性打开靶序列内部杂交，再在预杂交温度Ti下与报告探针杂交，形成部分双链复合物dsDNA(T1-S)-ssDNA(T2)；随后在较低温度Tf下与金电极表面捕获探针杂交，形成完整三明治双螺旋结构。最后利用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）识别生物素标记的报告探针，在TMB/H2O2体系中催化产生电化学电流。结果表明，多步温度控制可显著提高杂交效率和序列特异性，对单碱基错配和非互补序列具有良好区分能力，适用于结核分枝杆菌等易形成内部杂交的病原DNA检测。
英文摘要
A highly sensitive and selective method for amplified electrochemical detection for hairpin-stem-loop structured target sequences was developed based on the temperature regulation of DNA hybrids on a sandwich-type electrochemical DNA sensor. Multistep hybridization was applied to promote the hybridization efficiency of each section of sandwich structure. The results showed that both multistep and temperature-controlling hybridization techniques were both especially made to fabricate the sensor for the tendency of internal hybridization of target gene sequences. This strategy provides significantly enhanced hybridization efficiency and sequence specificity of electrochemical detection.