组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
凝血酶（thrombin）；样品基质：Tris-HCl 缓冲液（pH 7.42，含 NaCl、KCl、MgCl2）
检测原理
羧基功能化 SWCNHs 表面带负电，FAM-pep 因精氨酸残基在 pH 7.42 下带正电，二者通过静电作用形成 SWCNH–肽复合物，使 FAM 靠近碳纳米角表面并被高效猝灭。凝血酶作为识别对象，特异性识别并切割 FAM-pep 中的核心底物序列 LVPRG，导致肽链断裂；含 FAM 的片段与 SWCNHs 的相互作用减弱或脱离，FAM 荧光随之恢复。凝血酶浓度越高，被切割的 FAM-pep 越多，荧光恢复量 ΔF 越大。该体系未引入额外酶促或核酸放大，主要依赖 SWCNHs 的高猝灭效率实现信号增强，通过激发 480 nm、发射 522 nm 读取均相开启型荧光信号。
检测灵敏度
LOD: 100 pm
效应效果
该传感器对凝血酶表现出良好选择性：在 100 nM 干扰物（BSA、人 IgG、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡萄糖氧化酶、肌红蛋白）存在下，仅凝血酶引起显著荧光恢复，其他蛋白或蛋白酶响应较弱。方法重现性良好，相对标准偏差小于 5%。检测限为 100 pm，比基于氧化石墨烯–肽的荧光传感器（2 nM）提高约 20 倍；与文献报道的电化学适配体、化学发光适配体、比色和荧光适配体方法相比，检测限相当或更优，且检测时间仅约 2 min。SWCNHs 纯度高、稳定性好，可作为通用纳米猝灭剂，有望用于多种蛋白酶的多重检测。
传感器的构成
- 基底/换能器：无固相电极，均相 Tris-HCl 缓冲液体系（pH 7.42），直接荧光读取
- 纳米猝灭剂层：羧基功能化单壁碳纳米角（COOH-SWCNHs），由 SWCNHs 经 HNO3 氧化得到，提供负电荷表面并猝灭 FAM 荧光
- 识别探针层：FAM 标记肽（FAM-pep，FAM-GGLVPRGSG），含凝血酶核心底物序列 LVPRG，作为荧光探针和酶切底物
- 被测物识别事件：凝血酶（thrombin），特异性切割 FAM-pep 的 LVPRG 位点
- 信号标记物：荧光素（FAM）标记于肽链，被 SWCNHs 猝灭，酶切后荧光恢复
- 信号读出：荧光光谱仪（Perkin–Elmer LS55），激发 480 nm、发射 522 nm 监测 ΔF
中文摘要
蛋白酶在癌症、退行性疾病、凝血障碍、炎症和感染性疾病等多种疾病中发挥关键作用，因此亟需快速、灵敏的蛋白酶检测方法。本文首次报道了一种基于碳纳米管（CNT）的蛋白酶生物传感平台，并采用肽作为荧光探针。以单壁碳纳米角（SWCNHs）和凝血酶（thrombin）为例验证该策略：经硝酸氧化引入羧基的 SWCNHs 可吸附荧光素标记肽（FAM-pep），使 FAM 靠近碳纳米角表面而发生荧光猝灭；FAM-pep 含有凝血酶核心底物序列 LVPRG，凝血酶可特异性切割该肽，削弱 FAM 与 SWCNHs 之间的相互作用，从而使 FAM 荧光恢复。该均相荧光传感器对凝血酶具有较高灵敏度和选择性，检测限为 100 pm，整个检测可在数分钟内完成，为蛋白酶快速检测提供了简便、稳定的新途径。
英文摘要
Proteases play a central role in several widespread diseases. Thus, there is a great need for the fast and sensitive detection of various proteolytic enzymes. Herein, we have developed a carbon nanotube (CNT)-based protease biosensing platform that uses peptides as a fluorescence probe for the first time. Single-walled carbon nanohorns (SWCNHs) and thrombin were used to demonstrate this detection strategy. SWCNHs can adsorb a fluorescein-based dye (FAM)-labeled peptide (FAM-pep) and quench the fluorescence of FAM. In contrast, thrombin can cleave FAM-pep on SWCNHs and recover the fluorescence of FAM, which allows the sensitive detection of thrombin. This biosensor has a high sensitivity and selectivity toward thrombin, with a detection limit of 100 pM.