组成图示
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传感器类型
比色生物传感器
检测对象
葡萄糖（glucose），样品基质为PBS缓冲液/溶液
检测原理
该传感器基于GOD/HRP双酶级联比色反应。葡萄糖进入MSF大孔后，被GOD识别并催化氧化，生成H2O2；H2O2随即被共限制的HRP利用，催化TMB氧化为蓝色四唑化合物。TMB氧化产物在650 nm处具有特征吸光度，吸光度随葡萄糖浓度升高而增大，从而实现葡萄糖定量。MSF大孔将两种酶共限制在同一纳米空间内，使级联反应在孔内连续进行；受限空间会降低酶构象灵活性和底物扩散速率，使反应速率下降，但可拓宽线性范围。信号换能为化学显色-光学吸光读出，无电极和外部标记物。
检测灵敏度
线性范围: 5.0 × 10−5–1.0 × 10−2 M（GOD+HRP/MSF）；R^2 = 0.986；线性范围: 5.0 × 10−5–1.0 × 10−3 M（游离酶）；R^2 = 0.991
效应效果
共限制双酶在室温下的催化活性低于游离酶，表观Vmax降低，但抗变性能力增强。在GdmCl和尿素变性体系中，GOD+HRP/MSF的保留活性均高于游离酶；5 M尿素处理后，共限制酶仍保留50%活性，而游离酶仅保留14%。用于葡萄糖比色检测时，GOD+HRP/MSF的线性范围为5.0×10−5–1.0×10−2 M，相关系数0.986；游离酶线性范围为5.0×10−5–1.0×10−3 M，相关系数0.991。作者认为该体系比玻璃管中共固定GOD/HRP体系（线性范围110–580 mM）更具优势，适用于葡萄糖检测。
传感器的构成
- 基底/纳米反应器：大孔硅泡沫（MSF），P123模板法制备，孔径约100 nm，作为GOD/HRP共限制空间
- 识别/催化元件：葡萄糖氧化酶（GOD），物理吸附于MSF大孔内，催化葡萄糖氧化生成H2O2
- 信号催化元件：辣根过氧化物酶（HRP），与GOD共限制于MSF大孔内，催化H2O2氧化TMB
- 显色底物：3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB），被HRP/H2O2氧化为蓝色四唑产物，提供650 nm吸光信号
- 反应缓冲液：0.1 M PBS（pH 5.5），维持GOD/HRP活性并作为检测介质
- 信号读出：UV-vis分光光度计（UV-1102），在650 nm测定吸光度变化
中文摘要
本文以大孔硅泡沫（MSF）作为纳米反应器，将葡萄糖氧化酶（GOD）与辣根过氧化物酶（HRP）共限制于其大孔内，并研究孔内双酶级联反应对葡萄糖和3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）的氧化过程。通过紫外-可见光谱法测定反应动力学，利用Lineweaver–Burk图获得表观米氏常数（Kappm）和最大反应速率（Vmax）。结果表明，室温下共限制双酶的催化活性低于溶液中游离酶；但共限制酶在盐酸胍（GdmCl）和尿素等变性剂中表现出更高稳定性。将共限制双酶体系用于葡萄糖比色检测时，其葡萄糖线性范围宽于游离酶体系，说明MSF纳米反应器可在一定程度上改善酶传感器性能。
英文摘要
Investigation of the catalytic activity and stability of enzymes in confined nano/microspace provides valuable contributions to the fundamental understanding of biological reactions taking place on a mesoscopic scale within confined spaces. In this paper, macroporous silica foam (MSF) is used as a nanoreactor to co-confine glucose oxidase (GOD) and horseradish peroxidase (HRP). Then, the enzymatic cascade reactions, which act in tandem inside nanoreactors, for oxidation of glucose and 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) were studied. The catalytic kinetic parameters of apparent Michaelis constant (K(m)(app)) and maximum rate (V(max)) were obtained from Lineweaver-Burk plot by UV-vis spectrometry. Results showed that the catalytic activity of the co-confined enzymes is reduced compared to that of free enzymes in solution at room temperature. The stabilities of co-confined enzymes in denaturing agents, such as guanidinium chloride (GdmCl) and urea, were higher than those of free enzymes in solution. When employing a co-confined bienzyme system as a biosensor for the detection of glucose, a wider linear range of glucose was obtained for the co-confined bienzyme system than for free enzymes in solution.