组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
丙二酰辅酶A（malonyl-CoA，MCoA）；样品基质：活哺乳动物细胞（COS-1 细胞）胞内/核质代谢物
检测原理
该传感器以 FapR-VP16 为识别与转录激活元件。低 malonyl-CoA 时，FapR-VP16 结合 FapO 多聚体并招募 VP16 激活 CMV 最小启动子，驱动 D2eGFP 或荧光素酶转录；malonyl-CoA 与 FapR 结合后引起构象变化，使其从 FapO 解离，报告基因表达下降，因此报告信号与 malonyl-CoA 浓度呈负相关。nls-mCherry-PEST-Flag-2A-FapR-VP16 中的 2A 肽使 mCherry 与 FapR-VP16 等摩尔表达，作为转染与蛋白稳定性内参，GFP/mCherry 比值校正细胞间差异。信号放大依赖宿主细胞转录-翻译级联，D2eGFP 的短半衰期提高对代谢物变化的动态响应。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
传感器对 malonyl-CoA 代谢酶调控呈剂量依赖响应：共表达 MCD 或组成型活性 AMPKγ(R70Q) 降低 malonyl-CoA 时，GFP/mCherry 荧光和 Western blot 定量均升高；共表达 ACC1 升高 malonyl-CoA 时荧光素酶信号下降。荧光板读便于高通量，Western blot 更敏感但较繁琐。作者用该传感器筛选 myristoylated human kinase library，发现 LIMK1、MAPK13、CSNK1A1L 等候选激酶；LIMK1 使 [3H]acetate 掺入增加，并降低 CPT1a 介导的 [9,10-3H]palmitate 氧化（p<0.05 或 p<0.005）。作者认为其可用于活细胞脂肪酸代谢研究与代谢调节因子筛选，但信号依赖宿主转录翻译，需正交验证。
传感器的构成
- 宿主细胞/换能基质：COS-1 细胞，提供胞内表达、转录翻译与代谢环境
- 识别元件：FapR-VP16 融合蛋白，FapR 识别 malonyl-CoA，VP16 提供转录激活功能
- 调控序列：FapO 多聚体（34 bp FapR 操纵子片段）位于 CMV 最小启动子上游，响应 FapR-VP16 结合
- 报告基因：D2eGFP（半衰期约2 h）或荧光素酶（Luc），表达量反映 malonyl-CoA 水平
- 内参对照：nls-mCherry-PEST-Flag-2A-FapR-VP16，2A 肽使 mCherry 与 FapR-VP16 等摩尔表达，用于转染/稳定性校正
- 代谢调节元件：MCD、组成型活性 AMPKγ(R70Q)、ACC1，用于降低或升高胞内 malonyl-CoA 以验证传感器
- 信号读出：荧光板读（GFP 485/528 nm、mCherry 550/610 nm）、荧光素酶发光或 Western blot 定量
中文摘要
丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）是长链脂肪酸从头合成的限速代谢物，并通过别构抑制肉碱棕榈酰转移酶-1（CPT1）调控长链脂肪酸β-氧化。作者基于枯草芽孢杆菌中受 malonyl-CoA 调控的转录阻遏蛋白 FapR，开发了一种可用于活哺乳动物细胞的细胞内遗传编码生物传感器。该传感器将 FapR 与单纯疱疹病毒转录激活子 VP16 融合，并置于 FapR 操纵子片段 FapO 下游的 CMV 最小启动子控制下，驱动荧光素酶或短半衰期绿色荧光蛋白 D2eGFP 表达。在 COS-1 细胞中，malonyl-CoA 浓度波动可调节该 FapR 基传感器的转录活性；传感器能够以浓度依赖方式反映受 malonyl-CoA 脱羧酶（MCD）和 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）调控的 malonyl-CoA 通量变化。作者进一步利用该传感器筛选激酶表达库，鉴定出 LIMK1 等激酶，并证明 LIMK1 表达可改变脂肪酸合成与氧化速率。该简单遗传编码传感器可用于研究活哺乳动物细胞代谢特性，并支持新型代谢调节因子的筛选。
英文摘要
Malonyl-CoA is the rate-determining metabolite for long chain de novo fatty acid synthesis and allosterically inhibits the rate-setting step in long chain fatty acid β-oxidation. We developed a cell-based genetically encoded biosensor based on the malonyl-CoA responsive Bacillus subtilis transcriptional repressor, FapR, for living mammalian cells. Here, we show that fluctuations in malonyl-CoA, in mammalian cells, can regulate the transcription of a FapR-based malonyl-CoA biosensor. The biosensor reflects changes in malonyl-CoA flux regulated by malonyl-CoA decarboxylase and AMP-activated protein kinase in a concentration-dependent manner. To gain further insight into the regulatory mechanisms that affect fatty acid metabolism, we used the malonyl-CoA sensor to screen and identify several kinases. LIMK1 was identified and its expression was shown to alter both fatty acid synthesis and oxidation rates. This simple genetically encoded biosensor can be used to study the metabolic properties of live mammalian cells and enable screens for novel metabolic regulators.