组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
禽流感病毒 H5N1（AIV H5N1）；样品基质：PBS 稀释液、鸡拭子洗液（poultry swab samples）
检测原理
传感器以 Spreeta SPR 芯片为换能器，金（Au）表面经 NaOH/HCl 清洗后物理吸附链霉亲和素，再经生物素-链霉亲和素作用固定生物素化 DNA 适配体。样品中的 AIV H5N1 与适配体特异性结合，使金表面附近结合质量增加，局部折射率（RI）升高。LED 发出的偏振光入射到金膜上激发表面等离子体共振，结合层 RI 变化会改变共振反射角，反射光经反射镜进入光电二极管阵列，输出 RI 信号。该过程无标记、实时，RI 变化与病毒浓度在 0.128–1.28 HAU 内线性相关，R2=0.99。
检测灵敏度
LOD: 0.128 HAU；线性范围: 0.128–1.28 HAU；R^2 = 0.99
效应效果
该传感器对 H1N1、H2N2、H5N2、H5N9、H7N2、H9N2 等非靶标禽流感病毒交叉信号低于 H5N1 的 4%，特异性与 Dot-blot 相当。SPR 芯片经 NaOH/HCl 清洗可重复使用 5–7 次，直至 RI 下降 50%。在 PBS 和鸡拭子样本中均可在 1.5 h 内检测 0.128–12.8 HAU 的 AIV H5N1，检测限 0.128 HAU。与病毒分离（5–7 d）、ELISA（3 h）、RT-PCR（5 h）、实时 RT-PCR（3 h）和 NASBA（6 h）相比，具有快速、便携、无标记和实时检测优势，适合禽业现场筛查。
传感器的构成
- 基底/换能器：Spreeta SPR 芯片，集成 LED 光源、金 SPR 表面、反射镜、光电二极管阵列和温度传感器
- 表面清洗：1 M NaOH 与 1 M HCl 预处理 Au 表面，去除不规则物，获得清洁金表面
- 固定层：链霉亲和素（streptavidin）物理吸附于 Au 表面，提供生物素结合位点
- 识别元件：生物素化 DNA 适配体（biotinylated DNA aptamer）经生物素-链霉亲和素结合固定，特异性结合 AIV H5N1
- 样品层：PBS 稀释的灭活 AIV H5N1 或鸡拭子洗液中的 AIV H5N1
- 冲洗缓冲：PBS（10 mM，pH 7.4）冲洗未结合链霉亲和素、适配体和病毒
- 信号读出：SPR 折射率（RI）变化，由 LED 偏振光在金表面反射角变化经光电二极管阵列检测
中文摘要
由于高致病性 H5N1 禽流感病毒在动物和人类中暴发风险，快速、特异性检测禽流感病毒（AIV）十分迫切。适配体是人工寡核苷酸，可与特定靶标结合，对病毒具有与单克隆抗体相当的亲和力，且热稳定性更好。本研究以 DNA 适配体作为特异性识别元件，构建便携式表面等离子共振（SPR）生物传感器，用于鸡拭子样本中 AIV H5N1 的快速检测。将筛选得到的适配体生物素化后，通过链霉亲和素-生物素结合固定于涂覆链霉亲和素的传感器金表面。固定化适配体捕获样品中的 AIV H5N1，引起折射率（RI）升高。优化链霉亲和素和适配体参数后，RI 值与 AIV 浓度在 0.128–1.28 HAU 范围内呈线性关系（R2=0.99）。六种非靶标 AIV 亚型信号可忽略（<4% H5N1）。该适配体传感器可在 1.5 h 内检测鸡拭子样本中 0.128–12.8 HAU 的 AIV H5N1。
英文摘要
Rapid and specific detection of avian influenza virus (AIV) is urgently needed due to the concerns over the potential outbreaks of highly pathogenic H5N1 influenza in animals and humans. Aptamers are artificial oligonucleic acids that can bind specific target molecules, and show comparable affinity for target viruses and better thermal stability than monoclonal antibodies. The objective of this research was to use a DNA-aptamer as the specific recognition element in a portable Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor for rapid detection of AIV H5N1 in poultry swab samples. A SPR biosensor was fabricated using selected aptamers that were biotinylated and then immobilized on the sensor gold surface coated with streptavidin via streptavidin-biotin binding. The immobilized aptamers captured AIV H5N1 in a sample solution, which caused an increase in the refraction index (RI). After optimizing the streptavidin and aptamer parameters, the results showed that the RI value was linearly related (R(2) = 0.99) to the concentration of AIV in the range of 0.128 to 1.28 HAU. Negligible signal (<4% of H5N1) was observed from six non-target AIV subtypes. The AIV H5N1 in poultry swab samples with concentrations of 0.128 to 12.8 HAU could be detected using this aptasensor in 1.5 h.