组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
HIV-1 衣壳蛋白 CA（HIV-1 capsid protein CA）、HIV-1 Gag 前体蛋白（HIV-1 Gag precursor）/病毒组装位点；样品基质：HeLa-Kyoto 活细胞（转染 pcHIV 或 pcHIV.eGFP）
检测原理
CANTDcb1 与 eGFP 或 mCherry 融合后在 HeLa-Kyoto 细胞内表达。未结合时，荧光 chromobody 在胞质中弥散分布；当细胞表达 HIV-1 Gag 后，CANTDcb1 特异性识别 CA 的 N 端域 CANTD，并与 Gag 多聚化/膜靶向过程偶联，使荧光信号从弥散态转变为质膜上的焦点态。焦点的数量、强度和位置随病毒组装位点形成而增加，形成空间富集型信号放大。通过共聚焦显微镜、3D-SIM、FRAP 和高内涵成像读取荧光分布、恢复动力学和颗粒数，从而实现对 HIV-1 组装的动态定量检测。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数；仅报告结合亲和力 KD: 0.16 nM。
效应效果
CANTDcb1 结合 HIV-1 CA 全长蛋白和 N 端域 CANTD，不结合 CACTD 与 GFP，显示亚域选择性；QCM 测得 KD 为 0.16 nM。活细胞成像显示其与未标记 HIV-1 Gag 组装位点共定位，且不影响颗粒释放。3D-SIM 将质膜焦点分辨为约 130–160 nm 的单个病毒组装结构。FRAP 显示胞质结合态恢复慢于游离态，膜焦点几乎无恢复，提示稳定掺入。稳定细胞系 18 h 自动成像中，转染后约 6–9 h 出现由弥散到膜焦点的转变，可自动分割并定量颗粒数。作者认为该工具适用于抗病毒药物筛选和 HIV-1 变异体比较。
传感器的构成
- 识别元件：骆驼源单域抗体 VHH/nanobody CANTDcb1，特异性结合 HIV-1 CA N 端域（CANTD）
- 信号标记物：荧光蛋白 eGFP 或 mCherry，与 CANTDcb1 融合，提供可成像荧光信号
- 表达载体：pEGFP-N1 或改造 pEYFP-N1 质粒，编码 CANTDcb1-eGFP/mCherry 融合蛋白
- 细胞基质：HeLa-Kyoto 活细胞，作为表达与检测平台，转染 pcHIV 或 pcHIV.eGFP 产生 HIV-1 Gag
- 转染试剂：聚乙烯亚胺 PEI，用于 DNA/PEI 复合物转染
- 读出系统：共聚焦显微镜、3D-SIM、FRAP 与 InCell Analyzer 1000，读取荧光分布、动力学与颗粒数
中文摘要
在基础与应用 HIV 研究中，可靠检测病毒组分对监测感染进展至关重要。虽然体外检测病毒结构蛋白已用于诊断，但此前无法在不进行病毒遗传修饰的情况下，直接在活细胞中动态可视化 HIV。本文报道一种新型荧光生物传感器，用于动态追踪 HIV-1 在活细胞中的形态发生。作者通过免疫骆驼并筛选单域抗体库，获得特异性结合 HIV-1 衣壳蛋白 CA 的纳米抗体 CANTDcb1，其结合全长 CA 的 KD 为 0.16 nM，并优先结合 CA N 端域。将该纳米抗体与 eGFP 或 mCherry 融合后，形成荧光 chromobody，可在活细胞中特异性识别含 CA 的 HIV-1 Gag 前体蛋白。共聚焦活细胞显微镜和 3D-SIM 超分辨显微镜可检测并动态追踪质膜上单个病毒颗粒组装位点；FRAP 分析显示胞质抗原识别及向病毒组装位点的不可逆掺入。该工具还可用于自动图像分析，为基于细胞的 HIV 研究提供稳健手段。
英文摘要
In basic and applied HIV research, reliable detection of viral components is crucial to monitor progression of infection. While it is routine to detect structural viral proteins in vitro for diagnostic purposes, it previously remained impossible to directly and dynamically visualize HIV in living cells without genetic modification of the virus. Here, we describe a novel fluorescent biosensor to dynamically trace HIV-1 morphogenesis in living cells. We generated a camelid single domain antibody that specifically binds the HIV-1 capsid protein (CA) at subnanomolar affinity and fused it to fluorescent proteins. The resulting fluorescent chromobody specifically recognizes the CA-harbouring HIV-1 Gag precursor protein in living cells and is applicable in various advanced light microscopy systems. Confocal live cell microscopy and super-resolution microscopy allowed detection and dynamic tracing of individual virion assemblies at the plasma membrane. The analysis of subcellular binding kinetics showed cytoplasmic antigen recognition and incorporation into virion assembly sites. Finally, we demonstrate the use of this new reporter in automated image analysis, providing a robust tool for cell-based HIV research.