组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
睾酮（testosterone, T）、雌二醇（estradiol, E2）、胆固醇（cholesterol, C）；样品基质为环境水样/模拟环境样品（SIN 培养基、乙醇稀释及氯仿提取样品）。
检测原理
Comamonas testosteroni 的 hsdA 基因受类固醇诱导。RepA 结合 hsdA 上游两个操纵子抑制转录，RepB 在翻译水平抑制 hsdA mRNA。将 GFP 基因置于 hsdA 顺式调控区下游并同源整合，构建 CT-GFP5-1。类固醇进入细胞或细胞质后与 RepA 结合（睾酮还可结合 RepB），使 RepA 从操纵子解离，启动 hsdA-GFP 转录；GFP 表达产生荧光。荧光强度以 RFU（加样-空白）表示，随类固醇浓度升高而增加，在检测范围内近似线性；无细胞体系含转录/翻译组分，灵敏度提高2–3个数量级。高浓度时可能因荧光淬灭导致信号下降。
检测灵敏度
细胞基检测范围: testosterone 57–450 ng/ml (0.195–1.56 μM)、estradiol 1.6–12.8 ng/ml (0.006–0.048 μM)、cholesterol 19.3–154.4 ng/nl (0.050–0.390 μM)；无细胞检测范围: testosterone 28–219 pg/ml (0.1–0.78 nM)、estradiol 0.029–0.430 fg/ml (0.1–1.53 fM)、cholesterol 9.7–77.2 fg/ml (24.5–195 fM)；可检测 2 μl 0.1 fM estradiol（约600分子）。
效应效果
细胞基与无细胞系统均可检测睾酮、雌二醇和胆固醇，无细胞体系灵敏度比细胞基高2–3个数量级。雌二醇和胆固醇灵敏度高于睾酮，因睾酮可结合 RepB 产生清除效应。氯仿提取雌二醇回收率>95%（26.7 ng 时 RFU 43,315 对 42,992；13.3 ng 时 40,138 对 40,083；6.7 ng 时 39,158 对 39,363）。最大荧光信号30 min获得，细胞质可 -20°C 保存至少1个月。局限为高浓度荧光淬灭（睾酮>900 ng/ml 时 RFU 下降）、背景荧光较高，且不能区分不同类固醇。相比 HPLC、GC、ELISA 和质谱，作者主张该方法更便宜、简便、灵敏，适合环境水样类固醇检测。
传感器的构成
- 基底/反应载体：96孔黑色微孔板，承载细胞/细胞质与样品反应。
- 识别元件：CT-GFP5-1 中 hsdA 上游顺式调控区（启动子/操纵子）及反式调控因子 RepA/RepB，识别类固醇并调控转录。
- 报告信号元件：GFP 基因（720 bp）融合于 hsdA 调控区下游，类固醇诱导表达产生绿色荧光。
- 细胞基传感层：CT-GFP5-1 突变菌细胞（OD595=0.1，SIN 培养基），作为全细胞荧光传感体系。
- 无细胞传感层：CT-GFP5-1 细胞质（0.1 mg/ml 蛋白，SIN 培养基）并加入 pTOPO-3αGFP5 质粒（1 ng/ml），提供转录/翻译组分。
- 样品/反应基质：SIN 培养基、乙醇稀释样品及氯仿提取样品，用于环境类固醇样品处理与检测。
- 反应后处理液：ELISA 包被缓冲液（2×：70 mM NaHCO3、30 mM Na2CO3，pH 9.6），加入后弃上清干燥再加水，用于反应体系后处理。
中文摘要
来自 Comamonas testosteroni 的 3β-羟基类固醇脱氢酶/羰基还原酶是环境中类固醇降解的关键酶，其编码基因 hsdA 在无类固醇时仅低水平表达，存在类固醇底物时可被诱导数倍。前期研究已阐明 hsdA 的调控涉及多种激活因子与抑制因子。本研究将 hsdA 基因替换为绿色荧光蛋白（GFP）基因，并将其插入 hsdA 调控区下游，通过同源整合到染色体 DNA，构建突变株 CT-GFP5-1，用作基于荧光的类固醇检测生物传感器。该细胞基系统可测定睾酮 57–450 ng/ml、雌二醇 1.6–12.8 ng/ml、胆固醇 19.3–154.4 ng/nl。仅使用突变体细胞质可进一步提高灵敏度，无细胞系统可测定睾酮 28–219 pg/ml、雌二醇 0.029–0.430 fg/ml、胆固醇 9.7–77.2 fg/ml。提取回收率约95%，最大荧光信号在30 min获得。局限为高浓度淬灭和较高荧光背景，正在改进。综上，利用 hsdA 调控区构建的突变株可用于环境类固醇灵敏检测。
英文摘要
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