组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
大肠杆菌16S rRNA（E. coli 16S rRNA，rRNA标准品/杂交缓冲液）、金黄色葡萄球菌16S rRNA及细胞（Staphylococcus aureus 16S rRNA/cells，细胞裂解液）
检测原理
PNA探针通过生物素–亲和素作用固定在SPR金芯片表面。PNA骨架为中性，与16S rRNA杂交后，界面由中性变为带负电的RNA–PNA复合物。随后将缓冲液更换为低盐30 mM Tris，降低静电屏蔽，使阳离子氨基葡聚糖包覆金纳米颗粒通过静电作用特异性结合到杂交rRNA上。金纳米颗粒附着于SPR金膜附近，通过金膜与纳米颗粒间的强光学耦合/局域表面等离子体共振，引起SPR角度显著偏移。rRNA浓度越高，杂交复合物越多，结合的阳离子Au NPs越多，SPR角度偏移越大。非特异性探针通道用于扣除背景，实现无需PCR和标记的高灵敏度检测。
检测灵敏度
LOD: 58.2 ± 1.37 pg mL−1（E. coli 16S rRNA，信号放大）；LOD: 320 ± 16.76 ng mL−1（E. coli 16S rRNA，直接杂交）；S. aureus: 7 × 10^5 CFU
效应效果
该方法选择性良好：400 ng/mL大肠杆菌rRNA下，特异性PNA通道经阳离子金纳米颗粒放大后SPR角度偏移432 mD，非特异性通道46 mD，比值9.4倍。信号放大使大肠杆菌rRNA检出限由直接杂交的320±16.76 ng/mL降至58.2±1.37 pg/mL，灵敏度提高约5500倍；直接杂交可检测400 ng/mL，放大后可检测400 pg/mL。对金黄色葡萄球菌细胞裂解液无需纯化rRNA，优化后（DW悬浮、均质裂解）可检测7×10^5 CFU，约3 h完成。作者认为该方法无需PCR和标记，探针设计灵活，适用于细菌快速鉴定，但细胞检测灵敏度仍低于PCR和免疫分析。
传感器的构成
- 基底/换能器：玻璃基底上2 nm铬粘附层与45 nm金膜（Au film），提供SPR换能界面
- MUA自组装层：11-巯基十一烷酸（MUA）在金表面形成自组装单分子层，提供羧基
- 氨基葡聚糖层：500 K amino dextran经EDC/NHS偶联到MUA，增加亲水性并减少非特异结合
- 生物素化层：NHS-biotin与氨基葡聚糖氨基反应，形成生物素功能化表面
- 亲和素层：neutravidin结合生物素，提供PNA固定位点并降低阳离子纳米颗粒非特异结合
- 识别元件：biotinylated PNA probes（大肠杆菌/金黄色葡萄球菌特异性及非特异性）与16S rRNA杂交
- 封闭剂：biotin-dextran（MW 10,000）封闭未反应亲和素位点；ethanolamine封闭未反应羧基
- 信号放大层：cationic Au nanoparticles（MUA/氨基葡聚糖包覆金纳米颗粒）静电结合杂交rRNA，放大SPR信号
中文摘要
本文报道了一种基于肽核酸（PNA）捕获探针和表面等离子共振（SPR）传感器的高灵敏度大肠杆菌16S rRNA检测方法。16S rRNA是用于物种鉴定的遗传标记，由于拷贝数较高，可在不经PCR扩增的情况下直接分析。PNA具有中性骨架，与16S rRNA杂交后，传感器表面离子状态由中性变为负电性。作者合成了阳离子金纳米颗粒，使其通过静电相互作用与固定在PNA探针SPR芯片上的16S rRNA结合，从而实现信号放大。该方法将大肠杆菌rRNA的检出限降至58.2±1.37 pg/mL。利用该分析方法，无需纯化rRNA即可检测金黄色葡萄球菌，表明该方法可用于细菌快速鉴定。
英文摘要
A signal enhancing method allowing highly sensitive detection of E. coli 16s rRNA was developed using peptide nucleic acid (PNA) as a capture probe and a surface plasmon resonance (SPR) sensor as a detector. 16s rRNA has been used as a genetic marker for identification of organisms, and can be analyzed directly without PCR amplification due to the relatively high number of copies. PNA has a neutral backbone structure, therefore hybridization with 16s rRNA results in the ionic condition being changed from neutral to negative. A cationic Au nanoparticle was synthesized and used for signal amplification by ionic interaction with 16s rRNA hybridized on the PNA probe-immobilized SPR sensor chip. This method resulted in a detection limit of E. coli rRNA of 58.2+/-1.37 pg mL(-1). Using this analytical method, Staphylococcus aureus was detected without purification of rRNA.