组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
蛋白激酶抑制剂（protein kinase inhibitors，H89、ARC-902、ARC-341、ATP、ADP、PKI、RI、RII、Y-27632）、环磷酸腺苷（cAMP）；样品基质：含BSA的Hepes/NaCl/DTT缓冲液（溶液样品）
检测原理
ARC-583是TAMRA标记的双底物小分子探针，可同时占据PKA或ROCK的ATP结合位点和蛋白/肽底物结合位点。游离探针分子小、旋转快，荧光各向异性（FA）较低；与较大激酶结合后旋转受限，FA显著升高。当加入ATP竞争性抑制剂（如H89、ATP/ADP）或底物竞争性抑制剂（如PKI、RI、RII、Y-27632）时，它们与激酶结合并置换ARC-583，使FA随竞争配体浓度增加而下降，通过拟合得到IC50/Kd。对于cAMP，其结合PKA调节亚基后诱导全酶解离，释放催化亚基，使ARC-583结合增加、FA升高，从而以EC50反映cAMP浓度。该方法无酶催化放大，依赖高亲和力探针和荧光偏振比率检测。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。相关数值：KD = 0.48 nM（PKA C）、3.6 nM（ROCKII）；活性 PKA C 最低可靠测定 0.1 nM；Z' = 0.74。
效应效果
该均相FA方法无需底物、洗涤或抗体，单步孵育15 min，适合384孔HTS。加入0.05% BSA后荧光强度更高且稳定性更好，但动态范围由220 mA降至140 mA；24个阳性/阴性孔的Z'值为0.74，表明信噪比良好。FA测得的Kd与SPR及文献Ki/IC50高度一致，如H89对PKA C Kd=30 nM（文献Ki 15–48 nM），Y-27632对ROCKII Kd=27 nM（文献Ki 98 nM），ARC-902 Kd=0.33 nM（IC50=8.3 nM）。cAMP诱导PKA全酶解离的EC50为22和28 nM，可在1–200 nM范围作为cAMP传感器。作者认为该方法可低成本、高通量地筛选和表征PKA/ROCK抑制剂。
传感器的构成
- 检测容器：黑色低体积384孔非结合表面（NBS）微孔板，Corning，承载反应并减少吸附
- 检测缓冲液：50 mM Hepes（pH 7.5）、150 mM NaCl、5 mM DTT，维持反应环境
- 封闭剂：7.5 μM BSA，降低探针和激酶对孔壁/移液尖的非特异吸附
- 识别元件：PKA催化亚基（PKA C）或ROCKII，作为靶激酶与探针结合
- 信号标记物：ARC-583（Adc-Ahx-(D-Arg)6-D-Lys(5-TAMRA)-NH2），TAMRA标记双底物探针，结合后FA升高
- 竞争配体：H89、ARC-902、ARC-341、ATP、ADP、PKI、RI、RII、Y-27632，用于置换探针
- 读出装置：PHERAstar微孔板读数仪（BMG Labtech）FP模块，激发540 nm、发射590 nm，测量FA
中文摘要
本文报道了一种高亲和力双底物荧光探针ARC-583（Adc-Ahx-(D-Arg)6-D-Lys(5-TAMRA)-NH2），并描述了其在荧光偏振/各向异性结合与置换实验中的应用，用于表征cAMP依赖性蛋白激酶PKA和Rho激酶ROCK的ATP竞争性抑制剂及蛋白/肽底物竞争性抑制剂。该探针与PKA的结合解离常数为0.48 nM，因而可用于表征纳摩尔至微摩尔级活性的抑制剂，并可在单次实验以及高通量筛选（HTS）格式中测定激酶的活性浓度。由于该双底物探针可同时占据激酶的ATP结合位点和蛋白/肽底物结合位点，可被两类竞争性抑制剂置换，使单一探针能够覆盖不同作用机制的化合物。此外，该探针还可用于评估蛋白-蛋白相互作用，例如PKA调节亚基与催化亚基之间的结合，并作为环磷酸腺苷（cAMP）的生物传感器。
英文摘要
The bisubstrate fluorescent probe ARC-583 (Adc-Ahx-(D-Arg)(6)-d-Lys(5-TAMRA)-NH2) and its application for the characterization of both ATP- and protein/peptide substrate-competitive inhibitors of protein kinases PKA (cyclic AMP-dependent protein kinase) and ROCK (rho kinase) in fluorescence polarization-based assay are described. High affinity of the probe (K(D)=0.48 nM toward PKA) enables its application for the characterization of inhibitors with nanomolar and micromolar potency and determination of the active concentration of the kinase in individual experiments as well as in the high-throughput screening format. The probe can be used for the assessment of protein-protein interactions (e.g., between regulatory and catalytic subunits of PKA) and as a cyclic AMP biosensor.