组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
内体腔pH（pH/H+，endosomal acidification）；样品基质：活HeLa细胞内体-溶酶体囊泡（细胞培养体系）
检测原理
E1GFP是F64L/T203Y突变的GFP变体，其GFP发色团存在中性与阴离子质子化平衡，pK约6.0。将E1GFP融合到HIV-1 Tat蛋白后，Tat介导融合蛋白与细胞表面结合并经内吞进入内体-溶酶体途径。内体腔H+浓度升高使E1GFP发色团质子化状态改变，在403 nm激发下，500 nm与523 nm附近发射强度发生可逆变化。通过AOBS分束同时采集460–505 nm与505–600 nm发射，计算F505-600/F460-505比率，可得到不依赖探针浓度的pH值。该比率型荧光机制使信号随内体酸化单调变化，实现活细胞内体酸化的实时高时空分辨率成像。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
E1GFP对氯离子等卤素离子不敏感，适合内体酸化环境。体外与活细胞校准一致：方案#1 Rf为8.57/8.4，pK′为6.68/6.65；方案#2 Rf为4.97/5.09，pK′为6.42/6.40。细胞质pH为7.3±0.2。Tat-E1GFP内吞4 h后，膜附近囊泡pH 6.77±0.13，胞内囊泡为6.52（σ=0.11）和5.95（σ=0.17）；6 h后膜附近6.31±0.2，胞内5.83（σ=0.14）。氯喹使囊泡pH升至6.2±0.2并延缓降解。蛋白量前6 h稳定，8 h下降约40%，24 h消失。
传感器的构成
- 成像基底：35 mm玻璃底培养皿（WillCo-dish GWSt-3522），承载HeLa细胞并提供共聚焦成像界面
- 细胞基质：HeLa细胞（CCL-2 ATCC），作为内吞、内体形成与酸化的活细胞环境
- 表达载体：pcDNA3.1(+)或pGEX6P1质粒，用于编码E1GFP、caveolin-E1GFP或Tat-E1GFP融合蛋白
- 递送/靶向元件：HIV-1 Tat蛋白，融合于E1GFP C端，介导细胞表面结合、内吞并进入内体-溶酶体途径
- 传感/信号元件：E1GFP（F64L/T203Y GFP），pH响应荧光蛋白，通过GFP发色团质子化状态改变产生发射比率变化
- 光学读出模块：403 nm激光激发与AOBS分束检测，采集460–505 nm和505–600 nm发射并计算pH比率
中文摘要
基因编码荧光蛋白可作为监测细胞过程的理想报告分子，因为它们可通过与目标蛋白融合而靶向任意亚细胞区域。本文报道了一种pH敏感荧光蛋白E1GFP，其适合以高时空分辨率实时监测动态细胞器内的pH变化。E1GFP是一种基于发射的比率型pH指示剂，pK接近6.0。作者将其应用于内体-溶酶体途径中pH变化的测量。通过将E1GFP与具有细胞穿透能力的HIV-Tat蛋白融合，能够在实时条件下监测从细胞表面初始结合到细胞内内吞网络的多步内吞过程。该工作为利用E1GFP原位检测动态生物过程中的pH变化提供了框架。
英文摘要
Genetically encoded fluorescent proteins are optimal reporters when used to monitor cellular processes as they can be targeted to any subcellular region by fusion to a protein of interest. Here, we present the pH-sensitive fluorescent protein E(1)GFP which is ideally suited to monitor pH changes in dynamic intracellular structures in real time with high spatio temporal resolution. E(1)GFP is a ratiometric pH indicator by emission with a pK close to 6.0. We describe an application of this novel pH reporter in the measurement of pH changes along the endo-lysosomal pathway. By fusing E(1)GFP to the HIV-Tat protein which is endowed with cell-penetrating properties, we were able to monitor multi-step endocytosis from the initial cell-surface binding through to the intracellular endocytic network in real time. This represents a framework for the application of E(1)GFP to the in situ detection of pH changes involved in dynamic biological phenomena.