组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
胞内钙离子（intracellular Ca2+，活细胞/细胞培养物；GPCR 激活后胞质、线粒体、质膜等微域）；间接检测 GPCR 配体（agonist/antagonist，细胞培养物）
检测原理
GPCR 配体结合后，通过 Gq/11-PLC-IP3 途径促使内质网释放 Ca2+，或通过 Go 调节电压门控钙通道引起胞内 Ca2+ 升高。重组表达的 aequorin/Photina 先与 coelenterazine 结合形成活性光蛋白，其 Ca2+ 结合位点结合 Ca2+ 后诱导 coelenterazine 氧化为 coelenteramide，激发态弛豫发射 465/471 nm 蓝光；Ca2+ 浓度越高，发光越强。aequorin 结合 Ca2+ 后失活，适合单次事件检测；Photina 由 obelin 与 clytin 嵌合，信号更强、动力学更慢，适合 HTS。cameleons/camgaroos/pericams 中 Ca2+ 结合 calmodulin 引起构象变化，使 GFP 突变体靠近发生 FRET 或增强荧光，信号可逆。靶向序列将传感器定位到线粒体、质膜等微域，提高局部 Ca2+ 变化检测灵敏度，最终由 CCD、PMT 或 FLIPR 读出。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数；仅报告 Photina 信号约为 aequorin 的 3 倍、灵敏度约为标准荧光钙染料 FLIPR 的 10 倍，最低约 100 cells/well。
效应效果
与荧光钙染料相比，光蛋白背景低、信噪比高、动态范围大，且化合物自荧光干扰少。aequorin 可稳定表达并靶向线粒体、质膜、内质网等区室，用于区分 GPCR/Gq-IP3 与 GPCR/Go 通道介导的钙信号；Photina 信号比 aequorin 高约 3 倍，灵敏度比 FLIPR 荧光钙染料高约 10 倍，最低约 100 cells/well，可适配 1536 孔 ultra-HTS。cameleons、camgaroos 和 pericams 可逆、适合单细胞与活体成像，但需光激发、背景较高，主要用于基础研究。作者主张其可用于 GPCR 激动剂、拮抗剂、变构调节剂筛选、孤儿受体配体发现、离子通道/转运体筛选及活体钙信号成像。
传感器的构成
- 细胞基底：表达 GPCR 的活细胞（如 HEK293 细胞）提供受体、G蛋白与钙信号通路，作为传感平台。
- 换能元件：重组光蛋白 aequorin 或 Photina，结合 Ca2+ 后催化 coelenterazine 氧化并发光。
- 识别元件：aequorin/Photina 的 Ca2+ 结合位点（EF-hand 结构）或 cameleons/camgaroos/pericams 中的 calmodulin，特异性识别 Ca2+。
- 信号标记物：coelenterazine 作为 aequorin/Photina 发光辅因子，被氧化为 coelenteramide 并释放蓝光；GFP 突变体作为 cameleons 等荧光信号团。
- 靶向定位序列：SNAP-25、adenylyl cyclase、cytochrome c oxidase 等序列，将光蛋白定位到质膜、线粒体等亚细胞区室。
- 读出装置：CCD 相机、photomultiplier tube 或 FLIPR，检测发光或荧光信号。
中文摘要
G蛋白偶联受体（GPCR）是药物发现的重要靶点，绝大多数 GPCR 均可耦联 Ca2+ 信号。因此，许多基于细胞的高通量筛选（HTS）方法通过检测胞内 Ca2+ 变化来评估 GPCR 激活。传统方法使用荧光染料，其发射光强度与胞内 Ca2+ 浓度相关。另一种策略是重组表达生物传感器光蛋白，典型代表为水母素（aequorin）。这类光蛋白在胞内 Ca2+ 升高时产生强发光信号，具有极高灵敏度、高信噪比，并可利用靶向序列定位到特定亚细胞区室，从而检测 Ca2+ 微域。这些优势使光蛋白成为多种 GPCR 药物发现项目的首选工具，并逐渐用于配体门控离子通道和转运体激活检测。本综述重点讨论钙光蛋白在 GPCR 药物发现和 HTS 中的应用。
英文摘要
The G protein-coupled receptor (GPCR) family is a major target for drug discovery, and most, if not all, GPCRs can couple to Ca2+ signaling. Consequently, there are a number of cellbased, primary, high-throughput screening (HTS) assays used for drug discovery that assess changes in intracellular Ca2+ as a functional readout of GPCR activation. Historically, changes in intracellular Ca2+ levels have been readily detected using fluorescent dyes that emit light in proportion to changes in intracellular Ca2+ concentration. An alternative approach to indirectly measure changes in Ca2+ concentrations involves the use of recombinantly expressed biosensor photoproteins, of which aequorin is a prototypic example. These biosensors have the advantage that they provide an intense luminescent signal in response to elevations in intracellular Ca2+. This exquisite sensitivity, the high signal-to-noise ratios, and the ability to target expression to discrete subcellular sites (in order to detect Ca2+ microdomains) have made photoproteins a principal choice in a wide range of GPCR drug discovery programs. Photoproteins are also finding increasing use in detecting activation of other molecular target classes such as ligand-gated ion channels and transporters. This review focuses upon the use of calcium photoproteins principally for use in GPCR drug discovery and HTS.