组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
EGFR 胞外域（EGFR-ED），样品基质：HBS 缓冲液（10 mM HEPES、3.4 μM EDTA、150 mM NaCl、0.005% Tween 20）；细胞竞争结合实验另涉及 [125I]-rhEGF 与 A549 细胞表面 EGFR。
检测原理
SPR 实验中，CM-5 芯片经 EDC/NHS 活化后偶联 PDEA，再固定 E5-coil 或 K5-coil 捕获肽；互补的 E5/K5-coil-EGF 被捕获在表面，形成固定配体层。当含 EGFR 胞外域（EGFR-ED）的 HBS 缓冲液流过表面时，EGFR-ED 与固定 EGF 特异性结合，使金膜表面质量增加，局部折射率改变，导致 SPR 共振角偏移，仪器以共振单位（RU）记录传感器图。EGFR-ED 浓度越高，稳态结合平台越高；通过不同浓度 EGFR-ED 的稳态平台值可计算结合解离常数 kD。该过程无化学放大，信号直接反映结合质量变化。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2；SPR 分析 EGFR-ED 注入浓度范围为 500 nM–3.9 nM。
效应效果
coil 标记 EGF 能诱导 A549 细胞 EGFR 磷酸化，并促进 BRI-JM01 细胞增殖，活性与 rhEGF/mEGF 相当；1 ng/mL 时 [3H]-胸苷掺入增加约 50%。竞争结合实验显示 E5/K5-coil-EGF 与 rhEGF 竞争 [125I]-rhEGF 结合 EGFR 的能力相似。SPR 稳态分析得 E5-coil-EGF 与 EGFR-ED 的 kD 为 183 ± 12.1 nM，K5-coil-EGF 为 146 ± 6.11 nM，接近文献 mEGF/EGFR-ED 约 200 nM。E-coil-EGF 可将 K-coil 腺病毒重定向至 U87MG 胶质母细胞瘤细胞，p=0.012。复性后纯化收率约 20%，SPR 捕获表面稳定且无需再生。
传感器的构成
- 基底/换能器：Biacore CM-5 金膜传感器芯片，提供 SPR 换能表面
- 活化层：EDC/NHS 活化 CM-5 羧基表面，生成可与胺基反应的中间体
- 硫醇偶联层：PDEA（2-(2-吡啶基二硫基)乙胺）偶联到活化表面，提供硫醇基团
- 捕获层：E5-coil 或 K5-coil 肽（N端半胱氨酸）通过硫醇偶联固定，用于捕获互补 coil-EGF
- 固定配体层：E5-coil-EGF 或 K5-coil-EGF 被互补 coil 表面捕获约 70 RU，作为结合 EGFR-ED 的识别配体
- 封闭/清洗：50 mM 半胱氨酸在 0.1 M 甲酸钠 pH 4.0 中封闭未结合硫醇；5 M 盐酸胍去除非特异结合
- 分析物：EGFR 胞外域（EGFR-ED），以 3.9–500 nM 稀释系列注入 HBS 缓冲液
- 读出：Biacore 3000 SPR 仪器，以共振单位（RU）记录结合传感器图并进行稳态分析
中文摘要
表皮生长因子（EGF）可激活表皮生长因子受体（EGFR），在肿瘤靶向和再生医学中具有重要价值。本研究在大肠杆菌中表达并复性了 N 端融合 E5-coil 或 K5-coil 的人 EGF 融合蛋白（E5-coil-EGF 和 K5-coil-EGF）。融合蛋白以包涵体形式积累，经盐酸胍溶解、Ni-NTA 亲和纯化、半胱氨酸辅助氧化复性及 HPLC 纯化后，再用肠激酶切除 His 标签。EGFR 磷酸化和细胞增殖实验表明，coil 标记 EGF 的生物活性与未标记 EGF 相当。基于细胞的竞争结合实验和 SPR 生物传感器实验显示，E5/K5-coil-EGF 与 EGFR 胞外域的结合亲和力与未标记 EGF 相似。此外，E-coil-EGF 可将表达 K-coil 的腺病毒重定向至 EGFR 阳性的胶质母细胞瘤细胞。结果表明，大肠杆菌表达平台可稳定生产具有完整生物活性的 E/K-coil 标记 EGF，可用于病毒或纳米颗粒靶向及组织工程支架固定。
英文摘要
Heterodimerizing peptides, such as the de novo designed E5/K5 peptide pair, have several applications including as tags for protein purification or immobilization. Recently, we demonstrated that E5-tagged epidermal growth factor (EGF), when bound to a K4 expressing adenovirus, promotes retargeting of the adenovirus to EGFR expressing target cells. In this study, we present the Escherichia coli expression, refolding and purification of human EGF fused with the E5-coil (E5-coil-EGF) or with the K5-coil (K5-coil-EGF). EGF receptor phosphorylation and cell proliferation assays demonstrated that the biological activity of the coil-tagged EGF versions was comparable to that of non-tagged EGF. Additionally, analysis of the binding of E5/K5-coil-EGF to cell surface EGFR or to soluble EGFR ectodomain, as measured by cell-based binding competition assays and by SPR-based biosensor experiments, indicated that the coil-tagged EGF versions bound to EGFR with affinities similar to that of non-tagged EGF. Finally, we show that E-coil-tagged EGF, but not non-tagged EGF, can retarget a K-coil containing adenovirus to EGF receptor expressing glioblastoma tumor cells. Overall these results indicate that E. coli expression offers a practical platform for the reproducible production of fully biologically active E5/K5-coil-tagged EGF, and support applications of heterodimerizing coil-tagged ligands, e.g. the targeting of viruses or other entities such as nanoparticles to tumor cells, or growth factor immobilization on cell culture scaffolds for tissue engineering.