组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
HCV NS3/4A 蛋白酶（hepatitis C virus NS3/4A protease）活性；样品基质：HeLa 或 Huh-7 活细胞及细胞裂解液
检测原理
该传感器为基因编码 FRET 探针：ECFP 作为供体，citrine 作为受体，二者由含 HCV NS3/4A 蛋白酶切割位点 CSwt 的 linker 连接。在活细胞内，若存在活性 NS3/4A 蛋白酶，蛋白酶识别并切割 CSwt，使 ECFP 与 citrine 物理分离并扩散，二者距离增大。由于 FRET 效率与供体-受体距离的六次方成反比，切割后 ECFP 激发下 citrine 的敏化发射下降，表观 FRET 效率 Eapp 降低；蛋白酶活性越高或表达量越高，Eapp 下降越明显。系统通过 3-cube FRET 成像或分光荧光计读取 Eapp，并可同时计算 [D]/[A] 比值作为辅助读出。该设计无需外源标记或酶催化放大，依靠蛋白酶切割事件直接改变荧光能量转移距离实现单细胞定量检测。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
该 FRET 探针在 HeLa 和 Huh-7 细胞中可定量检测 NS3/4A 活性。单独表达时 Eapp 约 0.46，与 scNS3/4APt1 共表达后最低约 0.12。S139A 蛋白酶或 CSmut 探针均无 FRET 变化；Western blot 显示 56.7 kDa 蛋白切割为 28.3 kDa。相对 scNS3/4A-I389，scNS3/4A-i、-24、Pt1、A156V、A156T 催化效率约 61%、43%、207%、13%、8%。[D]/[A] 单独表达为 0.891±0.066，蛋白酶过量时升高。作者认为可用于变体表征和高通量筛选。
传感器的构成
- 表达平台/基底：HeLa 或 Huh-7 活细胞，承载基因编码 FRET 探针并允许 NS3/4A 蛋白酶在胞内切割
- 基因编码探针载体：pC-CSwt-Y 质粒，编码 ECFP-CSwt-citrine 融合蛋白，用于在哺乳动物细胞中表达 FRET 探针
- 供体荧光蛋白：ECFP（enhanced cyan fluorescent protein），作为 FRET 供体，430 nm 激发、约 475 nm 发射
- 识别/切割底物：22 氨基酸 linker 中的 CSwt 序列（EDVVCCSMSYTWTG），作为 HCV NS3/4A 蛋白酶识别与切割位点
- 受体荧光蛋白：citrine（EYFP 变体），作为 FRET 受体，约 531 nm 发射，与 ECFP 距离变化引起 FRET 效率变化
- 突变对照探针：pC-CSmut-Y 质粒，编码含 CSmut 序列（EDVVGGSMSYTWTG）的融合蛋白，用于切割特异性对照
- 蛋白酶表达载体：pcDNA3 系列质粒，表达 scNS3/4A 变体（如 scNS3/4APt1、S139A、A156V/T），提供被测蛋白酶
- 读出系统：倒置荧光显微镜/EM-CCD 与 3-cube FRET 滤光片组，或 LS-50B 分光荧光计，测量 Eapp 与 [D]/[A]
中文摘要
丙型肝炎病毒（HCV）NS3/4A 蛋白酶在病毒复制中起关键作用。本研究报道了一种用于在单个活哺乳动物细胞中监测该酶活性的荧光共振能量转移（FRET）探针。该探针由增强青色荧光蛋白（ECFP）与 citrine（增强黄色荧光蛋白变体）融合而成，二者之间的连接肽中嵌入 HCV NS3/4A 蛋白酶切割位点。在哺乳动物细胞中表达该生物传感器可产生 FRET 信号；与 NS3/4A 表达载体共转染后，FRET 信号显著降低，表明切割位点被蛋白酶加工。Western blot 和分光荧光分析证实融合探针被 NS3/4A 蛋白酶物理切割。由于 FRET 衰减程度取决于蛋白酶活性，该系统可用于检测具有不同催化效率的 NS3/4A 蛋白酶变体，并可改造用于高通量筛选新的 HCV NS3/4A 蛋白酶抑制剂。
英文摘要
The NS3/4A protease from hepatitis C virus (HCV) plays a key role in viral replication. We report a system for monitoring the activity of this enzyme in single living mammalian cells. We constructed a fluorescence resonance energy transfer (FRET) probe that consists of an enhanced cyan fluorescent protein-citrine fusion, with a cleavage site for HCV NS3/4A protease embedded within the linker between them. Expression of the biosensor in mammalian cells resulted in a FRET signal, and cotransfection with the NS3/4A expression vector produced a significant reduction in FRET, indicating that the cleavage site was processed. Western blot and spectrofluorimetry analysis confirmed the physical cleavage of the fusion probe by the NS3/4A protease. As the level of FRET decay was a function of the protease activity, the system allowed testing of NS3/4A protease variants with different catalytic efficiencies. This FRET probe could be adapted for high-throughput screening of new HCV NS3/4 protease inhibitors.