组成图示
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传感器类型
其他（BLI/SPR 无标记实时光学生物传感器）
检测对象
单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb/IgG）与抗原（antigen, Ag1/Ag2）的竞争性结合/表位阻断；样品基质为重组蛋白溶液、腹水来源纯化 mAb 及 PBS/BSA 缓冲液。
检测原理
该检测基于无标记实时光学质量传感。传感器表面经 EDC/NHS 或 EDC/SNHS 活化后，共价固定抗原或抗体；结合事件使界面质量或折射率改变，Octet 通过生物层干涉（BLI）光程变化、ProteOn 和 Biacore 通过表面等离子共振（SPR）响应读出。串联取向中，固定抗原先结合饱和抗体，再注入竞争抗体；若表位重叠，竞争抗体被阻断，响应接近基线；若表位不重叠，则出现结合响应。预混取向将抗原与一种抗体预先混合后注入固定抗体表面，仅当两种抗体不相互阻断时才发生结合。经典夹心取向固定一种抗体捕获抗原，再检测第二种抗体能否结合。信号大小反映可结合抗体量，阻断程度决定表位分箱。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
三种实验取向在 Octet、ProteOn 和 Biacore 上获得的表位分箱结果高度一致，证明无标记实时生物传感器可用于抗体表位表征。ProteOn 可在单周期内并行检测 36 个相互作用，Biacore 最多串行处理 4 个流池，Octet 一次浸入 8 个通道并可使用一次性传感器。作者指出 SPR 平台灵敏度通常优于 Octet QK，而 Octet 的离线包被和免再生操作提高无人值守通量。预混取向因含抗原单独结合内对照被认为最可靠。弱结合抗体 mAb 6 出现中间响应，可通过交换抗体角色、提高浓度或改用其他取向解决。文章未报告 RSD、回收率或加标实验。
传感器的构成
- 换能器基底：Octet 一次性氨基反应性光纤传感器（AR biosensor tips，BLI）、ProteOn GLC 传感器芯片（SPR）和 Biacore CM5 传感器芯片（SPR），用于固定识别元件并检测结合。
- 化学活化层：EDC/NHS 或 EDC/SNHS 活化表面，使抗原或抗体通过氨基共价偶联到传感器表面。
- 捕获识别层：山羊抗人 IgG Fc 多克隆抗体（goat anti-human IgG Fc polyclonal）用于在 ProteOn 上捕获含 Fc 融合伴侣的 Ag1。
- 识别/偶联层：重组抗原 Ag1（约100 kDa 二聚体）或 Ag2（30 kDa 单体）以及小鼠单克隆抗体 mAb/IgG 通过氨基偶联或捕获固定，作为结合探针。
- 封闭层：1 M 乙醇胺（ethanolamine）封闭过量反应基团，降低非特异性结合。
- 运行缓冲/封闭：PBS + 5 mg/mL BSA 或 PBS + 0.005% Polysorbate 20 作为运行缓冲，维持结合条件并减少非特异吸附。
- 信号标记物：无标记（label-free）检测，不添加荧光、酶或电化学标记物，信号来自结合引起的表面质量/折射率变化。
中文摘要
本文展示了无标记实时光学生物传感器在竞争性结合实验中的应用，通过对抗体面板进行表位分箱。作者描述了三种实验取向，即串联阻断、预混阻断和经典夹心阻断，并分别在ForteBio Octet QK、Bio-Rad ProteOn XPR36和GE Healthcare Biacore 3000三个平台上完成。通过成对检测抗体是否相互阻断对方与抗原的结合，建立每个抗体相对于面板中其他抗体的阻断谱，并利用阻断信息将具有相似表位的抗体归入同一“箱”。文章讨论了各生物传感器的优缺点、为特定相互作用系统选择最适当阻断实验取向时需考虑的因素，以及处理模糊数据的建议。不同实验取向和不同生物传感器获得的数据高度一致，证明这些仪器是表征抗体表位和具有生物学意义的多蛋白复合物的有价值工具。
英文摘要
We demonstrate the use of label-free real-time optical biosensors in competitive binding assays by epitope binning a panel of antibodies. We describe three assay orientations that we term in tandem, premix, and classical sandwich blocking, and we perform each of them on three platforms: ForteBio's Octet QK, Bio-Rad's ProteOn XPR36, and GE Healthcare's Biacore 3000. By testing whether antibodies block one another's binding to their antigen in a pairwise fashion, we establish a blocking profile for each antibody relative to the others in the panel. The blocking information is then used to create "bins" of antibodies with similar epitopes. The advantages and disadvantages of each biosensor, factors to consider when deciding on the most appropriate blocking assay orientation for a particular interaction system, and tips for dealing with ambiguous data are discussed. The data from our different assay orientations and biosensors agree very well, establishing these machines as valuable tools for characterizing antibody epitopes and multiprotein complexes of biological significance.