组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
PtdIns(3,4,5)P3（磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸），样品基质为 COS-1 细胞质膜、细胞裂解液及免疫沉淀复合物。
检测原理
EGF 刺激 COS-1 细胞后，PI3-kinase 将质膜 PtdIns(4,5)P2 磷酸化为 PtdIns(3,4,5)P3。GFP-PH/ARNO 的 PH 结构域特异性结合 PtdIns(3,4,5)P3，使探针从胞质募集到质膜，膜区 GFP 荧光增强。5-磷酸酶去除 PtdIns(3,4,5)P3 的 5 位磷酸，生成 PtdIns(3,4)P2，降低膜上 PtdIns(3,4,5)P3 水平，从而减少 GFP-PH/ARNO 膜募集。共聚焦显微镜采集单细胞图像，ImageJ 计算质膜与胞质 GFP 荧光强度比；该比值随 PtdIns(3,4,5)P3 升高而升高，随 5-磷酸酶活性增强而下降。体外则用放射性标记 PtdIns([32P]3,4,5)P3 与免疫沉淀酶反应，TLC 分离产物并灰度分析水解比例。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该方法可评估 5-磷酸酶对 PtdIns(3,4,5)P3 的特异性水解活性。GFP-PH/ARNO 依赖 PH 域识别 PtdIns(3,4,5)P3，可与仅结合 PtdIns(3,4)P2 的 TAPP1 PH 域探针区分产物；体外 TLC 能分离 PtdIns(3,4,5)P3 与 PtdIns(3,4)P2，通过灰度比较计算水解百分比。体内方法支持单细胞、时间分辨分析，可在 0、1、5、10 min EGF 刺激下观察质膜 PtdIns(3,4,5)P3 周转，并建议每时间点至少分析 10 个细胞、重复 3 次独立实验，避免高表达细胞。相比 [3H]-肌醇/HPLC 全细胞定量，该方法可定位膜微区，但依赖转染效率与表达水平。
传感器的构成
- 基底/换能器：COS-1 细胞质膜（plasma membrane），PtdIns(3,4,5)P3 生成与 5-磷酸酶作用部位
- 识别元件：GFP-PH/ARNO（绿色荧光蛋白融合 ARNO PH 结构域），特异性结合 PtdIns(3,4,5)P3 并募集至质膜
- 信号标记物：GFP（绿色荧光蛋白），提供荧光信号，膜/胞质荧光比反映 PtdIns(3,4,5)P3 水平
- 酶元件：5-磷酸酶（如 HA-PIPP、HA-72-kDa 5-phosphatase），去除 PtdIns(3,4,5)P3 的 5 位磷酸
- 读出装置：共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy）与 ImageJ，采集并量化膜/胞质荧光
中文摘要
磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸 [PtdIns(3,4,5)P3] 是响应胞外激动剂、由磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3-kinase）在质膜短暂合成的强效膜结合信号分子。PtdIns(3,4,5)P3 可招募含 PH 结构域的效应蛋白，调控细胞增殖、生长、迁移及胰岛素信号，因此其水平必须被严格限制。肌醇多磷酸 5-磷酸酶家族通过去除 PtdIns(3,4,5)P3 的 5 位磷酸，将其转化为 PtdIns(3,4)P2，从而衰减 PI3-kinase 依赖信号。本文介绍两种评估 PtdIns(3,4,5)P3 5-磷酸酶活性的方法：体外利用放射性或荧光标记 PtdIns(3,4,5)P3 底物，检测免疫沉淀重组酶或多蛋白复合物的水解产物；体内利用 PtdIns(3,4,5)P3 特异性荧光生物传感器 GFP-PH/ARNO 或其他结合蛋白，在生长因子刺激下观察其在质膜的募集与周转，并通过共聚焦显微镜和 ImageJ 进行单细胞定量。
英文摘要
Phosphatidylinositol 3,4,5 trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P3] is a potent membrane-bound signaling molecule transiently synthesized by phosphoinositide 3-kinase (PI3-kinase) in response to extracellular agonists. PtdIns(3,4,5)P3 signals need to be strictly controlled. PtdIns(3,4,5)P3 recruits and binds effectors that function in oncogenic signaling pathways. PtdIns(3,4,5)P3 activates cell proliferation, growth, and migration as well as regulating insulin signaling. The inositol polyphosphate 5-phosphatase family of enzymes dephosphorylate and thereby modulate PtdIns(3,4,5)P3 levels, attenuating PI3-kinase-dependent signaling. PtdIns(3,4,5)P3 5-phosphatase enzyme activity can be assessed in vitro by analysis of the hydrolysis of radiolabeled or fluorescently labeled PtdIns(3,4,5)P3 and in vivo by visualization of the recruitment and turnover of the PtdIns(3,4,5)P3-specific biosensor GFP-PH/ ARNO or other PtdIns(3,4,5)P3 binding proteins at the plasma membrane.