组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
Src 激酶活性（Src kinase activity）；样品基质为活细胞（HeLa、MEF、BAEC）质膜脂筏/非脂筏区室
检测原理
该传感器利用 FRET 比值报告 Src 激酶活性。CFP 与 YFP 之间夹有 Src 底物/磷酸化敏感序列；当生长因子（EGF/PDGF）或过钒酸盐（PVD）激活 Src 后，Src 磷酸化该序列，引起 CFP 与 YFP 相对距离或取向改变，从而改变 CFP 向 YFP 的荧光共振能量转移效率。CFP 激发后，FRET 增强时 CFP 发射降低、YFP 发射升高，CFP/YFP 比值随局部 Src 活性升高而变化。Lyn 酰化序列或 KRas 异戊二烯化序列将传感器分别锚定到质膜脂筏或非脂筏，FRB/FKBP 诱导异二聚化可进一步验证定位。荧光显微镜采集 CFP/YFP 图像，MetaFluor 计算比值，时间曲线经高斯拟合得到 T0、σ、A，实现单细胞区室定量。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
在 HeLa、MEF 和 BAEC 中，KRas-Src 对 EGF/PDGF/PVD 的响应快于且强于 Lyn-Src：PVD 下 A 分别为 0.5734±0.0122 与 0.3381±0.0088，T0 为 6.936±0.6320 与 14.042±0.1942。SYF−/− MEF 或 PP1 预处理抑制 PVD 诱导 FRET，说明信号主要来自 Src。CytoD 使 Lyn-Src 的 A 降至 0.2049±0.0366、σ 增至 4.474±0.4830，提示脂筏 Src 激活依赖肌动蛋白介导的膜转运；Noco 使 KRas-Src 的 T0 增至 14.263±0.9240、σ 增至 5.023±0.7430，提示非脂筏 Src 激活依赖微管。作者认为该方法可非侵入、单细胞、亚细胞区室定量 Src 动力学。
传感器的构成
- 细胞质膜微环境：活细胞质膜脂筏（lipid rafts）与非脂筏（non-raft）区室，作为传感器定位与 Src 活性检测的微环境
- 换能器/信号标记物：CFP（cyan fluorescent protein）与 YFP（yellow fluorescent protein）组成的 FRET 对，将磷酸化引起的构象变化转换为 CFP/YFP 荧光比值
- 识别/响应元件：Src 激酶底物/磷酸化敏感序列（Src biosensor core），被 Src 磷酸化后改变 CFP-YFP 能量转移
- 脂筏靶向修饰：Lyn 酰化序列（Lyn acylation sequence，N端 Gly-Cys，肉豆蔻酰化/棕榈酰化），将传感器锚定到脂筏
- 非脂筏靶向修饰：KRas 异戊二烯化序列（KRas prenylation sequence，KKKKKKSKTKCVIM），将传感器锚定到非脂筏
- 诱导异二聚化模块：FRB 融合 Src 传感器与 FKBP 融合 Lyn/KRas 靶向肽，AP21967/AP29167 诱导结合，实现可诱导膜定位
- 信号读出：CFP/YFP 发射比值（CFP/YFP emission ratio），经 MetaFluor 计算并拟合高斯函数
中文摘要
Src 是非受体酪氨酸激酶，参与细胞迁移、增殖和存活等过程，其活性受亚细胞定位精细调控。质膜并非均一，富含胆固醇、鞘磷脂和饱和脂肪酸的脂筏可作为信号平台，但 Src 在脂筏与非脂筏区室的调控机制仍不清楚，且传统去垢剂提取脂筏存在争议。为在活细胞中实时可视化局部 Src 活性，作者将基于 FRET 的 Src 生物传感器与膜靶向标签偶联：融合 Lyn 酰化序列（肉豆蔻酰化/棕榈酰化）将传感器靶向脂筏，融合 KRas 异戊二烯化序列将传感器靶向非脂筏，并采用 FRB/FKBP 诱导异二聚化系统验证定位。在 EGF、PDGF 和过钒酸盐刺激下，脂筏中 Src 活性诱导更慢、更弱，依赖肌动蛋白，可能与其介导 Src 从核周区域转运至质膜有关；非脂筏中 Src 活性诱导更快、更强，依赖微管。结果表明 Src 活性通过细胞骨架在质膜不同区室受到差异调控。
英文摘要
Membrane compartments function as segregated signaling platforms for different cellular functions. It is not clear how Src is regulated at different membrane compartments. To visualize local Src activity in live cells, a FRET-based Src biosensor was targeted in or outside of lipid rafts at the plasma membrane, via acylation or prenylation modifications on targeting tags either directly fused to the biosensor or coupled to the biosensor through an inducible heterodimerization system. In response to growth factors and pervanadate, the induction of Src activity in rafts was slower and weaker, dependent on actin and possibly its mediated transportation of Src from perinuclear regions to the plasma membrane. In contrast, the induction of Src activity in nonrafts was faster and stronger, dependent on microtubules. Hence, Src activity is differentially regulated via cytoskeleton at different membrane compartments.