Fluorescence detection of a protein-bound 2Fe2S cluster.

荧光生物传感器

蛋白结合 2Fe2S 铁硫簇（2Fe2S cluster，位于人源 Grx2）；样品基质：纯化 GFP-Grx2 蛋白溶液（HEG buffer），作者主张可扩展至细胞裂解液/活检等复杂样品。

该传感器基于蛋白融合荧光报告。人类 Grx2 在无 2Fe2S 簇时以单体存在，结合 2Fe2S 后形成由金属簇桥接的二聚体。将 GFP、BFP 或 CFP 融合到 Grx2 N 端后，二聚化及金属簇结合引起荧光蛋白构象/界面变化，导致荧光淬灭：GFP-Grx2 二聚体荧光较单体低 48%，BFP-Grx2 低 36%，CFP-Grx2 低 51%。当去除 GSH 并加入抗坏血酸时，2Fe2S 簇被破坏，Grx2 二聚体解离，荧光恢复；10 h 内二聚体荧光增加 71%，单体仅增加 4%。荧光恢复与椭圆度下降同步，单指数拟合 kobs=0.006 min−1。因此荧光强度随 2Fe2S 簇含量降低而升高，可在亚微摩尔蛋白浓度下监测单个蛋白的簇合成/降解动力学，无需酶促或核酸放大。

荧光 CV: <1% (≥200 nM), 2.6% (100 nM)；kobs=0.006 min−1；荧光淬灭: 48% (GFP)、36% (BFP)、51% (CFP)；荧光恢复: 71% (10 h)。

该荧光传感器在亚微摩尔浓度下具有较高测量精度：GFP-Grx2 二聚体荧光 CV 在 ≥200 nM 时 <1%，100 nM 时为 2.6%；相同浓度范围内圆二色椭圆度 CV 比荧光高 27 倍以上，5 µM 时仍高 16 倍。荧光变化与 CD 椭圆度下降同步，单指数动力学 kobs=0.006 min−1，说明荧光恢复真实反映 2Fe2S 簇丢失。GFP、BFP、CFP 融合蛋白均显示 36%–51% 的二聚体荧光淬灭，去除 GSH 并加抗坏血酸后 10 h 荧光恢复 71%，而单体仅 4%。作者认为该方法可用于小体积、高通量及细胞裂解液等复杂样品中单个蛋白 Fe–S 簇含量监测，并有望通过定向进化提高灵敏度以支持活检诊断。

多种线粒体疾病与依赖铁硫（Fe–S）金属簇的酶活性降低相关，但吸收、圆二色、电子顺磁共振、穆斯堡尔和拉曼等光谱法难以在活检等复杂样品中测定单个蛋白的 Fe–S 簇合成动力学。本文报道一种新型荧光检测法，用于监测缺乏上述局限性的蛋白结合 2Fe2S 簇含量。作者将绿色荧光蛋白（GFP）变体与人类 Grx2（谷胱甘肽依赖性氧化还原酶）融合；Grx2 无金属簇时为单体，结合 2Fe2S 后形成二聚体。凝胶过滤、吸收和圆二色光谱表明，GFP-Grx2 二聚体为 2Fe2S 桥接结构。与单体相比，二聚体 GFP-Grx2 荧光降低 48%，BFP-Grx2 和 CFP-Grx2 分别降低 36% 和 51%。去除谷胱甘肽（GSH）并加入抗坏血酸可破坏 2Fe2S 簇，使二聚体荧光在 10 h 内增加 71%，且荧光恢复速率与椭圆度下降速率一致（kobs=0.006 min−1）。在亚微摩尔浓度下，荧光测定的变异系数低于 1%（≥200 nM），显著优于圆二色法，可用于小体积、高通量及细胞裂解液等复杂样品中单个蛋白 Fe–S 簇含量的动力学监测。