组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
重组抗体片段 Fab57P（Fab57P antibody fragment）；样品基质：HBS-EP 缓冲液/溶液
检测原理
该传感器为无标记 SPR 亲和微阵列。金表面 OEG-SAM 上经 EDC/NHS 活化、微接触印刷生物素和链霉亲和素固定，形成 P1、P2、P3 单肽点及 P1+P2、P2+P3 混合点。P1、P2、P3 对 Fab57P 的 Kd 分别约 0.95、13、370 nM。当 Fab57P 流过表面时，与多肽特异性结合，使界面质量/折射率增加，导致 SPR 共振波长 λ_SPR 红移和 TM 反射率变化 ΔR_TM/R_TE。低浓度下高亲和 P1 点响应最强，高浓度下 P1 饱和而低亲和 P3 点仍保持响应；混合点提供介于两者之间的表观 Kd 和额外响应值。通过多点响应模式识别，可在不稀释样品情况下扩展定量动态范围。
检测灵敏度
LOD: ∼1 nM（ΔR_TM/R_TE = 0.001）；LOQ: ∼3 nM；检测浓度范围: 1–500 nM；上限较仅用 P1 提高 >10 倍
效应效果
阵列在 OEG-SAM 背景上未观察到 Fab57P 非特异结合，表明抗干扰能力较好。选择性实验中，50 nM Fab57P 与 1 μM 无关 IgG 混合液注入后，响应与单独 Fab57P 一致；加入 10 μM 过量 P1 后结合被有效抑制，仅残留由缓冲液折射率差异引起的微小信号。表面可用 10 mM glycine-HCl（pH 2.5）再生并保持结合能力。定量基于同一基底上 5 个阵列、每点五重复，误差棒为两倍标准差，显示重复性良好。作者认为该多配体亲和阵列可省略稀释步骤，适用于浓度跨度大的疾病生物标志物并行定量。
传感器的构成
- 基底/换能器：金涂层玻璃片（gold-coated glass slides），提供 SPR 换能表面
- 自组装单层：混合 OEG-SAM（mOEG/aOEG 烷硫醇），抗非特异蛋白吸附并提供羧基功能位点
- 活化层：EDC/NHS 处理 aOEG 羧基，生成 NHS 酯用于共价固定生物素衍生物
- 图案化锚定层：微接触印刷 (+)-biotin-(PEO)3-amine，形成离散生物素点
- 连接层：链霉亲和素（neutravidin）结合生物素，提供高亲和固定位点
- 识别元件：生物素化合成多肽 P1、P2、P3 及 P1+P2、P2+P3 混合点，以不同 Kd 结合 Fab57P
- 封闭剂：生物素化 P4 封闭剩余链霉亲和素位点
- 信号读出：iSPR 无标记监测 ΔR_TM/R_TE 与 Δλ_SPR 变化
中文摘要
本文描述了一种通过在同一亲和生物传感器检测面上使用一组对共同分析物具有不同亲和力的配体，以扩展分析物定量动态范围的概念。三种合成、生物素化多肽能够以不同亲和力（10^-9 M ≤ Kd ≤ 10^-7 M）结合一种模型蛋白分析物，并以微阵列形式固定在覆盖含聚乙二醇烷硫醇自组装单层的金片上。通过压电点样实现了包含单肽点以及多肽混合点的五元素亲和阵列。采用成像表面等离子共振（iSPR）研究分析物与不同点的结合。分析物定量下限约为 3 nM，相应上限较仅使用最高亲和力配体时提高了一个数量级以上。对于每个分析物使用多种配体的亲和阵列传感器，在省略稀释步骤以及并行定量多种浓度差异极大的疾病生物标志物等检测中特别有价值。
英文摘要
This work describes a concept for extending the dynamic range of quantification in an affinity biosensor assay by using a set of ligands with different affinities toward a common analyte. Three synthetic, biotinylated polypeptides capable of binding a model protein analyte with different affinities (10(-9) M < or = K(d) < or = 10(-7) M) were immobilized in a microarray format on a gold slide covered with an oligo(ethylene glycol)-containing alkane thiolate self-assembled monolayer. A five-element affinity array, comprising single-peptide spots as well as spots where peptides were immobilized in mixtures, was realized by means of piezodispensation. Imaging surface plasmon resonance was used to study binding of the analyte to the different spots. The lower limit of analyte quantification was approximately 3 nM and the corresponding upper limit was increased by more than an order of magnitude compared to if only the highest affinity ligand would have been used. Affinity array sensors with multiple ligands for each analyte are particularly interesting for omitting dilution steps and providing highly accurate data in assays where several analytes such as disease biomarkers with extremely variable concentrations are quantified in parallel.