组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
葡萄糖（glucose）；样品基质：体外蛋白溶液/缓冲液，文中拟用于活细胞内葡萄糖测量
检测原理
CoYi 为 ECFP–GBPm–YFPi 融合蛋白。葡萄糖与 GBPm 结合后，GBPm 的 flap 区发生构象重排，改变 N 端 ECFP 与 C 端 YFPi 的相对距离和取向，从而改变 FRET 效率。用 433 nm 激发时，ECFP 在 476 nm 发射，YFPi 在 526 nm 发射；通过计算 YFPi/ECFP 荧光强度比即可定量葡萄糖浓度。YFPi 的 pKa 约为 6.0，在酸性条件下荧光稳定，因此 pH 从 7.3 降至 5.3 时葡萄糖响应基本不变。该传感器为比率型荧光 FRET 检测，不依赖外部标记或酶放大。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2；报告 GBPm 对葡萄糖 pKd 为 589 μM、对半乳糖 pKd 为 848 μM，并称该 GIP 可测量至 5 mM；前代 GIP 在 0–20 μM 范围内响应良好。
效应效果
与含 EYFP 的 CoYo 相比，CoYi 显著降低 pH 干扰。CoYo 在 pH 7.3、6.2、5.2 时 EYFP/ECFP 强度比分别为 1.52、1.05、0.99，且 EYFP 荧光在 pH 6.2 降至约 30%、pH 5.2 下降 48%；CoYi 在 pH 7.3、6.3、5.2 时 YFPi/ECFP 强度比为 2.63、2.56、2.50，FRET 效率仅下降 2.7% 和 4.9%。不同 pH 下葡萄糖滴定曲线基本一致，实验重复三次并给出标准差。GBPm 对葡萄糖和半乳糖具有较高特异性，细胞内半乳糖浓度低，干扰可忽略。作者认为 CoYi 适合活细胞内葡萄糖连续荧光成像，并可能用于糖尿病相关研究。
传感器的构成
- 识别元件：突变葡萄糖结合蛋白 GBPm，结合葡萄糖并引起 flap 区构象变化，pKd 589 μM（葡萄糖）/848 μM（半乳糖）
- 换能器：ECFP–YFPi FRET 对，将葡萄糖结合引起的构象变化转换为荧光强度比变化
- 供体荧光标记：增强青色荧光蛋白 ECFP，位于 GBPm N 端，作为 FRET 供体，433 nm 激发后 476 nm 发射
- 受体荧光标记：pH 不敏感黄色荧光蛋白 YFPi，位于 GBPm C 端，作为 FRET 受体，526 nm 发射，pKa 6.0
- 连接支架：优化 linker 连接 ECFP–GBPm 与 GBPm–YFPi，传递葡萄糖结合引起的构象变化
- 纯化标签：C 端 His6 标签，用于 IMAC（Ni2+）亲和纯化，不直接参与传感信号
- 工作缓冲液：20 mM Tris-HCl、5 mM DTT、150 mM NaCl、1 mM CaCl2，透析去除咪唑并维持蛋白稳定
中文摘要
实时、非侵入地测定活细胞内葡萄糖浓度对研究葡萄糖转运、磷酸化及2型糖尿病和肥胖机制具有重要意义。作者此前基于大肠杆菌葡萄糖结合蛋白（GBP）构建了葡萄糖指示蛋白（GIP），通过葡萄糖结合诱导构象变化改变荧光共振能量转移（FRET）效率实现连续监测。然而，GIP 中使用的荧光蛋白对 pH 敏感，尤其酸性环境中性能下降，而细胞内 pH 会随代谢和细胞器位置波动。为此，本研究将突变葡萄糖结合蛋白 GBPm 的 N 端与增强青色荧光蛋白 ECFP 融合，C 端与 pH 不敏感黄色荧光蛋白 YFPi 融合，构建 pH 不敏感 GIP（CoYi）。实验表明，CoYi 在 pH 7.3 至 5.3 范围内对葡萄糖的响应基本保持不变，显著提高了酸性环境耐受性，有望用于细胞内葡萄糖的连续荧光成像监测。
英文摘要
There is an urgent need for developing a biosensor that can real-time and noninvasively determine glucose concentration within living cells. In our previous study, we have engineered a glucose indicator protein (GIP) that can provide continuous glucose monitoring through a conformation change-induced Förster resonance-energy transfer measurement. Because of the pH-sensitivity of the fluorescent proteins used in the GIP construction, the GIP made from these fluorescent proteins is less tolerant to a pH change, especially to the acidic environment. It has been well documented that intracellular pH does not always remain the same, and it fluctuates in metabolism and other cellular activities and also differs between cellular compartments. To address these issues, we developed a GIP that can tolerate to pH change. This GIP was constructed by flanking a glucose binding protein with a cyan fluorescent protein and a pH-insensitive yellow fluorescent protein. Our experimental results indicated that the new GIP is more tolerant to pH change. The glucose response of this new GIP kept almost unchanged from pH 7.3 to 5.3, suggesting its capability of tolerating to acidic environment. This capability is desirable for intracellular glucose measurement.