组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
钙离子（Ca2+）、环磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶A（PKA）、半胱天冬酶-3（caspase-3）、半胱天冬酶-6（caspase-6）、Ras GTP酶（H-Ras/K-Ras）、Rab5、磷脂酶C（PLC）、二酰甘油（DAG）、钙调磷酸酶（calcineurin）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）等；样品基质：活细胞（living cells）
检测原理
基因编码 FRET 生物传感器由供体荧光蛋白、受体荧光蛋白和中间传感域组成。当胞内目标分子或酶活性事件发生时，传感域发生构象变化、蛋白切割或结合/解离，使供体与受体之间的距离或取向改变。由于 FRET 效率强烈依赖距离和取向，供体荧光强度或寿命下降，受体敏化发射上升，形成比率、寿命或强度信号。多参数成像通过光谱分离的双 FRET 对、FRET-FLIM、空间区室化或与合成钙探针联合，将不同参数分配到不同激发/发射窗口或不同细胞区室，从而在单细胞中同时读出多个生化参数。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
综述总结多参数 FRET 成像的实际表现：双 FRET 对可实现单细胞同时成像四个参数；mTFP1/YFP 与 mAmetrine/tdTomato 的通道交叉分别约 3% 和 14%，可用简单强度校正；fura-2 与 CFP/YFP 在共享发射通道的交叉不超过 5%，可用校正因子处理；mCherry 因量子产率低导致敏化发射弱，mTagRFP 光稳定性限制连续成像帧数。非切割对照证明一个 FRET 对的变化不影响另一对。FLIM 降低光谱资源占用，空间分离可实现真正同时成像。作者认为该方法将成为活细胞信号研究的标准实践，但仍需强敏化发射的橙/红 FRET 对和与 CFP/YFP 光谱分离的合成钙探针。
传感器的构成
- 表达基质：活细胞（living cells），作为基因编码 FRET 传感器的表达与成像环境
- 供体荧光蛋白：CFP、mTFP1、YFP、mAmetrine，作为 FRET 供体，其荧光强度或寿命随能量转移效率变化
- 受体荧光蛋白：YFP、mCherry、tdTomato、tHcRed、mPlum、DsRed、mRFP1，作为 FRET 受体，产生敏化发射或用于寿命成像
- 识别/传感域：caspase-3/6 底物、RBD、Epac1、PKA/PKC 底物、calmodulin/troponin C 等，将胞内事件转换为 FRET 对距离或取向变化
- 亚细胞定位序列：NLS、质膜定位序列等，用于将不同传感器限制在细胞核、质膜或胞质等区室
- 可选合成钙探针：fura-2、indo-1、fura red，作为第二参数 Ca2+ 荧光指示剂，与 FRET 对联合成像
中文摘要
不同颜色荧光蛋白之间的 Förster（荧光）共振能量转移（FRET）为设计和构建用于检测胞内事件的生物传感器提供了稳健基础。目前，已开发出一系列针对生物相关离子、分子和特定酶活性的 FRET 型生物传感器，并用于研究细胞生物学中的诸多问题。FRET 型生物传感器使用的一个新兴趋势是将其与第二种生物传感器联用，从而在单个活细胞中同时成像多个生化参数。本文讨论 FRET 型生物传感器用于多参数活细胞荧光成像时面临的特殊技术挑战，并重点介绍克服这些挑战的近期工作。此外，本文综述了近期应用，并对该领域未来机遇进行展望。
英文摘要
The phenomenon of Förster (or fluorescence) resonance energy transfer (FRET) between two fluorescent proteins of different hues provides a robust foundation for the design and construction of biosensors for the detection of intracellular events. Accordingly, FRET-based biosensors for a variety of biologically relevant ions, molecules, and specific enzymatic activities, have now been developed and used to investigate numerous questions in cell biology. An emerging trend in the use of FRET-based biosensors is to apply them in combination with a second biosensor in order to achieve simultaneous imaging of multiple biochemical parameters in a single living cell. Here we discuss the particular technological challenges facing the use of FRET-based biosensors in multiparameter live cell fluorescence imaging and highlight recent efforts to overcome these challenges. In addition, we survey recent applications and provide an outlook on the future opportunities in this area.