组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）、胰岛素样生长因子结合蛋白-5（IGFBP-5）（并筛选IGFBP-1–6）；样品基质：重组蛋白溶液/HBS-EP缓冲液
检测原理
该检测基于表面等离子共振（SPR）质量传感原理。首先将生物素化9–10FNIII通过生物素–链霉亲和素（biotin–SA）相互作用固定于SPR芯片表面，形成识别层。随后，含IGFBP的HBS-EP缓冲液流过芯片，IGFBP-3或IGFBP-5与9–10FNIII上的RGD和PHSRN协同位点发生特异性结合。结合事件使芯片表面质量/折射率增加，导致SPR共振角偏移，仪器以响应单位（RU）实时记录结合与解离曲线。随着IGFBP浓度升高，平衡结合量增加，响应信号增强；解离后信号下降。若IGFBP预先与IGF-I共孵育，IGF-I占据IGFBP的IGF结合位点并改变其构象或占据界面，使其与9–10FNIII的结合减少，表现为响应降低，从而实现竞争性抑制检测。该方法无酶放大，直接监测蛋白–蛋白相互作用。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
在六种IGFBP中，仅IGFBP-3和IGFBP-5与固定化9–10FNIII结合，显示选择性；IGFBP-5结合程度高于IGFBP-3，可能与其较快结合速率有关。10 μM IGF-I共孵育可抑制两者结合。定点突变显示，9–10FNIII-KGD使IGFBP-3和IGFBP-5结合分别降低21%和75%，PHAAA突变分别降低48%和85%，GG插入分别降低33%和77%。平均平衡亲和力为：IGFBP-3对野生型9–10FNIII 50±13 nM，IGFBP-5为17±3.9 nM；突变体亲和力数值相近但Rmax显著下降。实验重复三次，数据以mean±SD表示，p<0.05。作者认为该结合可影响细胞外基质中IGF可用性、细胞黏附及凋亡相关过程。
传感器的构成
- 换能器基底：SPR生物传感器芯片（Biosensor 3000用SA涂层芯片），提供表面等离子共振信号读出
- 固定化层：链霉亲和素（SA）涂层，用于捕获生物素化配体
- 识别配体层：生物素化9–10FNIII（biotinylated 9–10FNIII），含RGD与PHSRN位点，作为识别元件
- 分析物：IGFBP-3/IGFBP-5（及IGFBP-1–6），流动相中与固定化配体结合
- 竞争抑制物：IGF-I（10 μM），与IGFBP共孵育以竞争性阻断结合
- 运行缓冲液：HBS-EP缓冲液，维持结合、解离与再生条件
中文摘要
本研究采用表面等离子共振（SPR）生物传感器技术，系统考察六种高亲和力胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP-1至IGFBP-6）与纤连蛋白（FN）细胞结合域（CBD）的相互作用。作者以纤连蛋白第9和第10型III结构域（9–10FNIII）的生物素化衍生物作为固定化配体，将其通过链霉亲和素（SA）固定于SPR芯片表面，再让不同浓度IGFBP流过表面，实时监测结合与解离过程。结果表明，在六种IGFBP中，只有IGFBP-3和IGFBP-5能够与9–10FNIII结合，且IGFBP-5的结合程度高于IGFBP-3。进一步实验显示，IGF-I可竞争性抑制IGFBP-3和IGFBP-5与9–10FNIII的结合；对IGFBP-5而言，其结合依赖于C端肝素结合域。通过对9–10FNIII进行定点突变，作者发现RGD位点和PHSRN协同位点均对两种IGFBP的最大结合至关重要。这些结果提示IGFBP-3/5可能通过结合纤连蛋白CBD参与细胞外基质中IGF活性的局部调控。
英文摘要
We have used Surface Plasmon Resonance (SPR) - based biosensor technology to investigate the interaction of the six high affinity insulin-like growth factor binding proteins (IGFBP 1-6) with the cell binding domain (CBD) of fibronectin. Using a biotinylated derivative of the ninth and tenth TypeIII domains of FN ((9-10)FNIII), we show that IGFBP-3 and -5 bind to FN-CBD. We show that this binding is inhibited by IGF-I and that, for IGFBP-5, binding occurs through the C-terminal heparin binding domain of the protein. Using site-directed mutagenesis of (9-10)FNIII, we show both the "synergy" and RGD sites within these FN domains are required for maximum binding of both IGFBPs. We discuss the possible biological consequences of our results.