组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
eIF4A（eukaryotic initiation factor 4A，真核起始因子4A）；样品基质：HeLa、HEK293、CHP134细胞粗裂解液，以及纯eIF4A点样膜
检测原理
4Aapt RNA通过3′ poly(A)尾与芯片上生物素化oligo(dT)16杂交固定，保持天然构象。当含eIF4A的细胞裂解液流过芯片时，eIF4A与4Aapt高亲和结合（Kd 27 nM），在识别层表面累积质量。SPR换能器检测表面折射率/共振角变化，以共振单位（RU）实时反映结合量；随机N40 RNA芯片作为对照扣除非特异结合。样品经链霉亲和素琼脂糖、oligo(dT)纤维素、BSA和随机RNA处理及0.45 μm过滤，减少非特异结合和颗粒干扰。eIF4A浓度越高，结合质量越大，净RU越高，从而在纳克水平实现无标记实时检测。
检测灵敏度
dot-blot可检测约300 ng eIF4A；SPR可检测至少10 ng eIF4A；10、30、100 ng eIF4A分别产生50、120、210 net RU。
效应效果
该适配体芯片对eIF4A具有选择性：突变4Aapt和N40随机RNA对照在点印迹与SPR中均不产生特异信号，高KCl洗涤可去除非特异结合蛋白。点印迹最低检测约300 ng天然eIF4A，BSA无假阳性。SPR中2 μg HeLa裂解液在4Aapt芯片约150 RU，N40芯片40–50 RU，净100–110 RU，估算约35 ng eIF4A（约17.5 ng/μg总蛋白）；Western blot估算为5–10 ng/μg，SPR略高但趋势一致。不同细胞系RU顺序与Western blot一致（HEK293>HeLa>CHP134），估算CHP134约20 ng/μg、HEK293约57 ng/μg。作者认为该系统可快速、半定量、无标记直接检测细胞裂解液eIF4A，可替代或等效抗体。
传感器的构成
- 基底/换能器：BIAcore SA型SPR传感芯片；提供表面等离子共振换能
- 亲和捕获层：链霉亲和素（streptavidin）；特异性结合生物素化寡核苷酸
- 固定化手柄：生物素化寡聚胸苷（biotinylated-oligo(dT)16）；与链霉亲和素结合并捕获poly(A)尾适配体
- 识别元件：3′-poly(A)尾4Aapt RNA（anti-eIF4A RNA aptamer）；通过poly(A)-oligo(dT)杂交固定并识别eIF4A
- 阴性对照识别层：poly(A)尾N40随机RNA；用于扣除非特异结合
- 样品掩蔽/封闭：BSA与poly(A)尾随机RNA处理裂解液；减少非特异结合
- 信号读出：BIAcore 2000 SPR仪器；无标记实时监测共振单位（RU）变化
中文摘要
适配体是体外筛选的短单链DNA或RNA序列，对靶分子具有高亲和力和特异性。本文证明，针对真核起始因子4A（eIF4A）筛选的RNA适配体可作为高效生物传感器。将该适配体固定于树脂后，可从粗细胞裂解液中通过亲和pull-down纯化eIF4A；32P标记适配体可通过点印迹检测约300 ng eIF4A。进一步，利用固定化适配体传感芯片建立表面等离子共振（SPR）检测法，在优化样品制备后，可在完整细胞裂解液中于纳克水平检测eIF4A，从而实现对细胞裂解液中eIF4A的实时传感。eIF4A是eIF4F复合物亚基，参与翻译起始，其异常表达与肿瘤相关，因此该适配体SPR系统可作为抗体替代或等效的快速、半定量、无标记检测工具。
英文摘要
Aptamers are short single-stranded DNA or RNA sequences that are selected in vitro based on their high affinity to a target molecule. Here we demonstrate that an RNA aptamer selected against eukaryotic initiation factor 4A (eIF4A) serves as an efficient biosensor. The aptamer, when immobilized to resin, purifies eIF4A from crude cell extracts by affinity pull-down, and 32P-labeled aptamer can detect some 300 ng of eIF4A by dot-blot analysis. Moreover, by use of an aptamer-immobilized sensor chip, we developed a surface plasmon resonance assay to detect eIF4A at the nanogram level within whole cell lysates after optimizing sample preparation, thereby showing a real-time sensor for eIF4A in cell extract solution.