组成图示
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传感器类型
其他（原子力显微镜生物传感器）
检测对象
HCV核心抗原（HCV core antigen, HCVcoreAg，PBS缓冲液）、乙肝表面抗原（HBsAg，PBS/Tween-20）、抗肌钙蛋白C抗体（anti-cTrC，PBS/Tween-20）、血浆蛋白（去高丰度蛋白血浆）
检测原理
固定于云母芯片的抗HCVcore抗体与样品中的HCVcoreAg发生亲和结合。可逆模式下，复合物数量受抗原浓度和Kd共同限制，洗涤后部分复合物解离，信号随浓度升高而增加，但受热力学平衡限制。不可逆模式下，先用ASBA光交联剂修饰抗体，再在UV照射下使已结合的抗原-抗体复合物形成共价键，克服解离平衡；此时捕获的复合物数正比于样品体积中目标蛋白分子数，增大样品体积可进一步降低检测限。AFM以轻敲模式扫描芯片表面，游离抗体高度约1.5 nm，复合物高度>2 nm，通过高度直方图统计复合物数量，实现单分子水平定量。
检测灵敏度
LOD: 10^-11 M（可逆AFM捕捞）；LOD: 10^-15 M（不可逆AFM捕捞，1 mL样品）；LOD: 10^-16 M（不可逆AFM捕捞，50 mL样品）；OB DL: 10^-9 M（anti-HBsAg/HBsAg可逆）；OB DL: 10^-10 M（cTrC/anti-cTrC可逆及不可逆）；1-DE+LC-MS/MS DL: 1.3×10^-8 M（校正后3.3×10^-9 M）；Cy5-sat DL: 7.4×10^-11 M
效应效果
与现有方法相比，AFM生物特异性捕捞显著降低检测限：1-DE+LC-MS/MS约10^-8 M，Cy5饱和标记约7.4×10^-11 M，光学生物传感器约10^-9–10^-10 M；AFM可逆捕捞为10^-11 M，不可逆捕捞在1 mL样品中为10^-15 M，在50 mL样品中为10^-16 M，较常规方法低约4个数量级。可逆模式增大样品体积不能提高灵敏度，不可逆模式检测限随体积增大而降低。实验使用15000±1000个固定抗体/400 μm²芯片，测量误差取1000个复合物，至少三次重复。作者认为该方法有望高通量检测血浆中超过100万种蛋白，约占血浆总蛋白一半，有助于早期疾病生物标志物发现。
传感器的构成
- 基底：云母（mica）片，提供原子级光滑表面用于AFM成像与分子固定
- 表面修饰：氨基硅烷化（aminosilanized）层，提供氨基供EDC/NHS共价偶联抗体
- 识别元件：抗HCVcore抗体（anti-HCVcore），共价固定于芯片，特异性结合HCVcoreAg
- 光交联剂：ASBA（4-[p-azidosalicylamido]butylamine），在EDC/NHS活化下修饰抗体，UV照射后形成共价复合物
- 样品基质：PBS缓冲液中的HCVcoreAg（HCV core antigen），从1或50 μL体积中捕捞
- 信号标记：无外源标记，抗体-抗原复合物高度高于游离抗体（>2 nm）作为AFM识别信号
- 读出探针：AFM NTEGRA与NSG10悬臂梁，轻敲模式扫描并统计高度>2 nm的复合物
中文摘要
由于蛋白质缺乏类似PCR的扩增手段，极低浓度蛋白的检测限成为蛋白质组学瓶颈。本文提出将生物特异性不可逆捕捞与原子力显微镜（AFM）结合，用于检测极低丰度蛋白。AFM能够识别单个分子及其复合物，而生物特异性捕捞利用大体积样品中分析物与芯片表面固定配体之间的亲和作用，将目标蛋白富集到微小芯片表面。捕捞可在依赖解离常数Kd的可逆模式和不受Kd限制的不可逆模式进行。作者测定了两种已有蛋白质组学方法的检测限：基于2-DE或LC分离后质谱分析的方法约为10^-8–10^-10 M；基于蛋白微阵列和光学生物传感器检测分子相互作用的方法约为10^-9–10^-10 M。所提出的AFM捕捞方法在可逆结合条件下达到10^-11 M，在不可逆结合条件下达到10^-16 M，显著拓展了低丰度蛋白的检测范围。
英文摘要
In the absence of an analog of PCR for proteins, the concentration detection limit (DL) becomes a real challenge. The problem may be solved by means of a combination of biospecific irreversible fishing with atomic force microscopy (AFM). AFM offers the ability to register individual molecules and their complexes, while biospecific fishing takes advantage of an affine interaction between analyte molecules spread over a large volume of biomaterial and ligand molecules immobilized on the chip surface. Fishing may be conducted in Kd-dependent reversible mode and in Kd-independent irreversible mode. In this study, the DLs of two previously applied proteomic approaches were determined and compared to the DL of a newly developed analytical method. The first approach, based on MS analysis of biomaterial after 2-DE or LC separation of proteins, attained a DL at the level of 10(-8)-10(-10) M. The second approach, based on the optical biosensor analysis of molecular interactions in the format of proteomic microarrays, had a DL of 10(-9)-10(-10) M. Our proposed method which combines biospecific fishing with AFM allowed us to attain DL values of 10(-11) M under reversible binding conditions and 10(-16) M under irreversible binding conditions.